1、材料与方法
1.1菌株和基因
植酸酶appA基因(Uniprot ID:P07102)克隆自大肠杆菌K12，锚定蛋白pGSA基因(ACT52837.1)采用全基因合成(合成基因的载体骨架为pET-30a)，锚定蛋白和植酸酶的融合可参考文献，融合后的载体为pET-30a-pGSA-appA。其中，锚定蛋白pGSA和乘客蛋白AppA之间需用柔性肽(GGGGSGGGGS)连接，以消除pGSA和AppA之间的干扰，融合后的表面展示蛋白命名为pGSA-appA。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和一株从黑土中分离的菌株皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii)G3分别作为基因的克隆和表达宿主，质粒转化通过二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP)营养缺陷型的大肠杆菌(Escherichia coli)WM3064作为供体菌进行偶联转移实现。INTEGRATE系统所用载体pSPIN骨架的构建步骤可参考文献。其中，CRISPR间隔区的Spacer序列(32 nt)用于基因的靶向定位，R end和L end之间的区域为Cargo区(其中包含目的基因)。具体基因和引物序列见表1。
表1本研究使用的基因和引物序列
1.2主要试剂和仪器
卡那霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；二氨基庚二酸，Sigma-Aldrich公司；植酸钠、细菌基因组提取试剂盒、土壤速效磷含量检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；超级感受态细菌制备试剂盒、Taq酶、Pfu酶，上海碧云天生物技术股份有限公司。
PCR仪，Bio-Rad公司；其他所需材料可参考文献。
1.3载体构建
本研究使用的最终表达载体可参考图1中的pGSA-appA-pSPIN，该载体主要由QCascade(CRISPR区、Cas基因表达区)、TnsABC(转座酶表达区)和Donor(Cargo区)3部分组成。载体构建的步骤包括Spacer区改造、启动子改造和Cargo区改造，其中植酸酶融合蛋白的启动子为J23119组成型启动子。利用SnapGene软件构建载体图谱，引物设计和无缝克隆模拟也通过该软件完成。载体的构建步骤主要包括载体线性化和无缝连接，详细步骤参考文献。
▲图1 pGSA-appA-pSPIN载体图谱
1.4载体的接合转移
使用E.coli DH5α扩增目的载体pSPIN-pGSA-appA，并通过超级感受态细菌制备试剂盒制备E.coli WM3064供体感受态，随后将pSPIN-pGSA-appA转化至E.coli WM3064。将携带载体的供体菌株WM3064与受体菌R.pickettii G3按照2:1的比例置于含有50μg/mL卡那霉素和50μmol/L DAP的LB培养基中，37℃培养过夜(~10 h)，具体过程可参考文献。利用卡那霉素抗性筛选接合子后，使用细菌基因组提取试剂盒提取接合子基因组，并通过引物27F(5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ)和CM2R(5ʹ-CACCCATAAATTGATAATTATCACACCC-3ʹ)对接合子基因进行PCR，PCR反应可参考文献完成。
1.5植酸酶活性检测
植酸酶活性的测定采用改良的磷酸根显色法，该方法主要通过磷酸根与钼酸盐反应生成磷钼酸复合物，随后被还原生成蓝色钼蓝，最后根据样品的吸光度值在标准曲线中换算磷酸根浓度。
100 mmol/L的NaAc-HAc缓冲液：取4.101 5 g无水乙酸钠，溶于500 mL蒸馏水中，用乙酸调节至pH 6.0。植酸钠底物溶液：配制6.25 mmol/L的植酸钠溶液，取1.443 5 g肌醇六磷酸钠，溶于NaAc-HAc缓冲液中(现配现用)。终止液：5%三氯乙酸溶液(5%TCA)。显色液：将4份试剂A与1份试剂B混合，现配现用。试剂A：取7.5 g钼酸铵，溶于400 mL蒸馏水中，加入22 mL浓硫酸，定容至500 mL，配成1.5%的钼酸铵溶液，4℃保存。试剂B：配制2.7%硫酸亚铁溶液，取6.75 g十二水硫酸亚铁，溶于250 mL蒸馏水中，4℃保存。KH2PO4母液(50 mmol/L)：取0.680 5 g KH2PO4固体，溶于100 mL 0.1 mol/L的NaAc-HAc缓冲液中。
取0.1 mL菌液，置于37℃水浴预热5 min，加入0.4 mL底物溶液并充分混合，置于37℃水浴反应30 min后，加入0.5 mL终止液及0.5 mL显色液，显色10 min，检测OD700数值。
取0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L的KH2PO4标准液各0.1 mL，置于37℃水浴预热5 min。反应结束后，取1 mL上述样品于狭缝比色皿，用分光光度计测量OD700，根据分光光度计数值绘制标准曲线。
1.6基因修饰菌的酶活性能分析
取对数生长期(OD600约为0.7)的基因修饰菌液，7 000 r/min离心5 min，去上清后收集菌体。菌体用生理盐水吹洗3次，将清洗后的菌体重悬于生理盐水中，制成细胞密度为1.0×108 CFU/mL的细胞悬浮液。
设置不同植酸钠底物浓度，取0.1 mL上述菌液于37℃水浴预热5 min；加入不同浓度的植酸钠底物溶液0.4 mL，混合均匀后置于37℃水浴反应30 min；加入终止液，混匀；加入显色剂显色10 min；取1 mL上述样品于狭缝比色皿，用分光光度计测量OD700；通过标准曲线获取水解后的磷酸根浓度。
取0.1 mL菌液于37℃水浴预热5 min，加入0.1 mmol/L的植酸钠底物溶液0.4 mL，并使用盐酸和氢氧化钠溶液分别调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，37℃水浴反应30 min，后续检测方法同上。
1.7基因修饰菌对土壤植酸的活化
将500 g过筛黑土土壤与10 mL生理盐水清洗后的R.pickettii G3菌液(OD600值为1.0)混合均匀后，放入5粒大小均匀的已发芽大豆种子，每组重复5次(以无菌的生理盐水作为对照)。从播种大豆开始，每7天取一次表层土壤，储存于-80℃冰箱待测。称取0.1 g过筛土样，加入1 mL NaAc-HAc缓冲液，1 500 r/min振荡1 h，10 000 r/min离心10 min，取上清液0.1 mL作为待测样品(空白组将菌液换成缓冲液即可)，按照植酸酶活性检测方法进行操作。土壤植酸酶活性(单位U/g)计算如公式(1)所示。
土壤植酸酶活性(U/g)=[(A₁-A₀)×k×L×D]/(M×T×V)(1)
式中：k为标准曲线斜率，A1和A0分别为反应30 min和对照的OD700值，L为提取植酸酶时加入的缓冲液总体积，D为提取液稀释倍数，M为称取的土样质量，T为反应时间，V为反应液的体积。
取不同时间段的土壤，利用试剂盒检测土壤速效磷含量，检测方法可参考试剂盒说明书。使用SPSS 30.0.0进行ANOVA分析。
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