2结果
2.1细胞接种
将处理好的53份猫眼、口、鼻拭子样品接种F81细胞，共有33份样品出现了CPE，细胞表现出聚集、圆缩、脱落、崩解等现象（图1）。
2.2 FCV分离及鉴定及VP1基因同源性和遗传进化分析
2.2.1分离及鉴定将53份样品的细胞上清液进行FCVVP1基因PCR鉴定，发现共有31份细胞上清出现2 010 bp左右目的条带（图2），与预期片段大小相符。53份样品的FCV分离率为58.49%（31/53），其中宠物医院样品分离率为46.67%（14/30），猫舍样品分离率为73.91%（17/23）。
2.2.2VP1基因同源性和遗传进化分析FCVVP1序列比对分析结果（表1）显示：31株分离株间的核苷酸同源性为75.3%～99.8%，与国内FCV疫苗株255的同源性为74.8%～78.3%，与国外FCV疫苗株F4的同源性为73.7%～78.6%，与跛行综合征株2280的同源性为74.3%～79.0%，与2016年发现的美国超强毒株VS-FCV-Ari的同源性为73.9%～77.1%。同国际分离株相比，31株分离株与美国3786株的同源性较高，与美国超强毒株VS-FCV-Ari的同源性最低。与国内分离株相比，与国内吉林株CH-JL4的同源性最高，与湖北HB-S4株的同源性最低，与2014年上海SH2014株的同源性为75.9%～80.3%。相应的氨基酸序列分析表明，31株分离株与255疫苗株的同源性为85.5%～89.1%，与F4疫苗株的同源性为83.1%～90.1%，与超强毒株VS-FCV-Ari的同源性为82.3%～86.8%，与上海SH2014株的同源性为83.7%～89.5%。FCVVP1基因遗传进化分析结果（图3）显示：31个分离株总体上可以划分为3个分支。第一分支只包括FCV20-11和FCV20-29，其与疫苗株、超强毒株和国内外的一些分离株亲缘关系较近，形成一个独立分支，进化关系最为复杂，来源也最为广泛；第二分支只包含14株分离株，遗传进化关系最为简单，已经形成独立的遗传进化谱系；第三分支包括15株分离株及其他3株国内毒株。结果表明，FCV进化关系较为复杂，且本地分离株具有多样性。
表1 31株FCV分离株与各参考毒株VP1基因同源性比较结果%
2.3 FHV-1分离、鉴定及gB基因同源性分析
2.3.1分离与鉴定将上述细胞上清液作为模板，进行FHV-1gB基因PCR检测，结果有2份细胞上清出现1 798 bp左右目的条带（图4），与预期片段大小相符，FHV-1的分离率为3.77%（2/53），2份样品均来自于宠物医院。
2.3.2gB基因同源性分析FHV-1gB基因序列比对分析结果（图5）显示，2株分离株间的核苷酸同源性为100%，与国内株（GD2018、CHB）、美国经典株（C-27）、澳大利亚株（Feligen）及其他参考株的同源性均为100%。
2.4 FIV鉴定
将53份尿囊液进行HA检测，结果均为阴性，未分离到病原。将其第3代尿囊液进行HA通用RT-PCR检测，结果也均为阴性。
3讨论
近年来随着人民生活水平的提高，猫作为伴侣动物已逐渐成为城市生活的一部分。经过初步统计，上海市家养宠物猫数量已达21万只，流浪猫数量更是达到了27万只。猫上呼吸道疾病在大量猫同居的环境中尤其严重，包括动物收容所、猫舍和半野生动物群落。FCV和FHV-1被认为是引起猫上呼吸道疾病的主要病原，常引起鼻气管炎、结膜炎和鼻/面部溃疡等，虽然原发感染相对轻微，但继发感染对幼猫或免疫功能低下的猫构成较大威胁，并可能导致致命后果，而FIV可能会对家养伴侣动物及人类健康带来重大影响。
本研究通过细胞培养和鸡胚接种方法，对上海市秋冬季部分具有上呼吸道症状猫的眼、口、鼻拭子进行FCV、FHV-1、FIV分离鉴定，发现FCV分离率为58.49%（31/53），其中猫舍样品的分离率高达73.91%（17/23），推测主要原因是猫舍为群居场所，猫间接触频繁，容易造成相互传染，因此猫的频繁接触和混居是FCV传播和流行的重要因素。FHV-1分离率不高，仅为3.77%（2/53）。FHV-1是间歇排毒，并且大多数情况下潜伏在三叉神经，所以病毒分离相对较为困难。2株分离株间的核苷酸同源性为100%，与其他参考株的同源性同样均为100%。目前对FHV-1分离株的研究相对较少。国内王吉等分离的5株FCV分离株的核苷酸与参考株同源性大于99%。同时有研究表明，FHV-1与其他水痘病毒的gB基因具有高度相似性。gB蛋白作为免疫原性蛋白，在哺乳动物细胞中究竟如何影响FHV-1感染宿主及其在宿主体内的增殖仍需进一步研究证明。31份FCV阳性样本中未同时分离得到FHV-1。虽然两种病毒都能感染F81细胞，但是两者的CPE和生长曲线并不一致，可能导致两者不能同时被分离到。采用鸡胚接种方法未分离到FIV，可能是临床猫FIV感染率较低，也可能与FIV的一过性感染特性有关，或者是该病毒培养方法并不适用FIV分离，具体原因有待进一步研究。本研究采集临床中具有呼吸道疾病症状猫的口鼻拭子样本进行检测，所得结果为病毒核酸检出率，不能代表猫的实际感染情况。
FCV虽然只有1个血清型，但抗原很容易变异。目前针对FCV感染无特效药，疫苗是控制该病的重要手段。在分离到FCV的31份临床病例中，70.97%（22/31）的病例都免疫了进口“妙三多”（FPV、FCV和FHV-1）疫苗，但仍然感染FCV并导致发病，说明目前的猫三联疫苗并不能保护机体抵御所有FCV毒株的感染，因此疫苗保护率差是造成FCV感染的因素之一。国内同样有研究显示，该疫苗对FCV保护力不佳。有研究表明，使用灭活的FCV颗粒进行鼻内免疫可对猫的同源和异源病毒提供强有力的保护。通过反向遗传技术也使FCV疫苗研究取得了一定进展。本研究中，FCV分离株间的核苷酸同源性为75.3%～99.8%，与FCV疫苗株255和F4的同源性都不高，与美国超强毒株VS-FCV-Ari的同源性只有73.9%～77.1%。国内相关研究同样表明，FCV感染比较普遍，且毒株相互间的同源性不高，来源复杂。因而，今后有必要继续进行FCV等病毒的流行情况调查。
综上所述，本研究通过细胞培养分离获得了31株FCV分离株和2株FHV-1分离株，并进行了基因序列分析，初步了解了上海市猫上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1和FIV的感染比例以及病原的遗传变化特点，为猫呼吸道病毒性疾病诊断试剂及疫苗研究奠定了基础。
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