摘要
为了解我国牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)田间毒株流行情况及遗传进化情况并观察其生物学特征，本研究对临床疑似发生牛结节性皮肤病的牛皮肤结节样本进行PCR检测、病毒分离、免疫荧光鉴定、电镜观察、GPCR基因测序和遗传进化分析。结果表明：利用原代羊睾丸细胞(PLT)分离得到3株牛结节性皮肤病病毒(LSDV)，分别命名为LSDV/Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株和LSDV/Jiangxi/2022株，对三株病毒进行一步生长曲线测定，前96 h病毒增长速度最快，96~120 h时滴度最高，之后病毒生长速度开始减缓，接种96 h后滴度最高，三株病毒分别可达到106.0 TCID50·mL-1、105.3 TCID50·mL-1和105.1 TCID50·mL-1。透射电镜下病毒粒子呈椭圆形，病毒直径为200~300 nm。将三株病毒GPCR基因序列与中国各地区以及近年其他国家流行毒株进行遗传进化分析，三株分离株与中国各地区毒株均处于同一分支上，说明中国各地区牛结节性皮肤病的流行有很强的相关性。本研究成功从黑龙江、吉林及江西三省牛皮肤结节病料中分离出三株LSDV，丰富了我国LSDV的流行病学及病原学数据，并对LSDV的持续监测与新型疫苗研发工作有参考意义。
牛结节性皮肤病(lump skin disease，LSD)又称牛疙瘩性皮肤病、牛结节性皮炎、牛块状皮肤病。是由痘病毒科(Poxviridae)，山羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)的牛结节性皮肤病病毒(lump skin disease virus，LSDV)引起的牛全身性传染性疾病。LSDV是带囊膜的线性双链DNA病毒，该病毒只有一个血清型。世界动物卫生组织(WOAH)将其列为必须通报的疫病，我国于2019年8月12日在新疆伊犁首次发现该病，目前将其列为二类动物疫病。牛结节性皮肤病主要传播媒介是吸血节肢动物，潜伏期长达28 d，特点是发热、淋巴结节肿大、皮肤黏膜结节性病变、皮肤水肿，结节破溃后可长达数月不愈。此病的发生会导致奶牛患乳房炎并且产奶量暂时减少，动物体重增加缓慢，公牛不孕不育等，造成较大经济损失。LSDV在很长一段时间中仅存在于南非地区，此后逐渐向非洲东部和北部扩散，2012年以来LSD迅速扩散至整个亚洲以及欧洲地区，包括俄罗斯、土耳其、孟加拉国、印度、越南、蒙古国以及泰国等国家，并于2019年传入中国，2020年传至东南亚国家。
LSDV与绵羊痘病毒(SPV)、山羊痘病毒(GPV)基因序列相似性达到96%~97%，仅在基因组末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差异。P32蛋白是LSDV囊膜表面一种主要结构蛋白，含有主要抗原表位，是羊痘病毒属最主要免疫原性基因，能在病毒感染的初期刺激宿主产生抗体阻止病毒扩散，但该抗体无法阻止病毒在攻毒部位的复制。研究人员在对P32蛋白的研究中发现，羊痘病毒属中P32蛋白与其它痘病毒属的一样，拥有比较高的同源性，是所有LSDV的分离株中共有的特异性高、免疫原性强的结构蛋白，研究表明其体外表达产物可用于建立血清学诊断技术。GPCR基因(G-protein-coupled chemokine receptor)属于趋化因子家族，与痘病毒中位于基因组左端的单拷贝基因——Q2/3L为同源基因，在病毒感染宿主后，可影响宿主的免疫反应，与病毒宿主嗜性有关。在不同CaPV的成员中会各自发生不同位点的变异，可以以此来对SPPV、GTPV、LSDV进行分组鉴定，此外该基因还可以应用于LSDV野毒株和疫苗株的区分。
目前我国已有14个省份正式报告和记录了LSD疫情。LSD的暴发主要在中国东南部，包括安徽、浙江、江西、福建、广东、广西、香港、四川和台湾等地，多数地区LSD流行株的病原学特征和流行病学情况仍有待研究。
本研究采集来自黑龙江、吉林以及江西三省2022年临床发病牛皮肤结节样品进行病毒分离鉴定，并对GPCR基因进行遗传进化分析，以了解当前LSDV的流行情况。
1材料与方法
1.1样品采集以及处理
采集黑龙江、吉林和江西三省的疑似LSDV感染牛皮肤结节组织样品，剪碎后加入适量无菌PBS溶液匀浆混匀，制成约10%组织匀浆，双抗4℃作用7 h并反复冻融3次，5 000 g离心10 min后弃沉淀，取上清液用0.45μm过滤器过滤，收集滤液置于-80℃冰箱，用于后续试验。
1.2主要试剂、仪器及细胞
Phanta Max Master Mix(Dye Plus)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；特级胎牛血清(FBS)购自北京绿源伯德生物科技有限公司；DNA Marker DL500购自TaKaRa公司；DMEM/F-12为Gibco公司产品；病毒DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自Sigma-AldrichⓇ公司；倒置荧光显微镜(DMi8)购自Leica公司；PCR仪(847-x-070-724)购自analytik-jena公司；原代羊睾丸细胞(PLT)为本实验室制备。
1.3组织样本PCR检测
按天根生物试剂盒说明书提取病料核酸，并于-20℃保存。参照《OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册2021第8版》使用病毒黏附蛋白(P32)编码基因特异性引物LSDV-F/R进行PCR检测，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。
表1本研究所用引物信息
25μL PCR反应体系：Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL，DNA模板1μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1μL，双蒸水补至25μL，充分混匀。PCR扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，48℃退火15 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.4病毒的细胞病变效应及其TCID50测定
将PCR检测为LSDV阳性的病料上清接种于原代羊睾丸细胞，37℃、5%CO2培养一周，每天观察并记录细胞的CPE现象，若无CPE现象继续盲传，直至出现CPE现象。收集出现CPE现象的细胞上清，使用P32蛋白基因的引物LSDV-F/LSDV-R进行PCR鉴定，引物序列见表1。将收集的细胞上清按照10-1~10-8进行倍比稀释，并接入96孔板中按照Reed-Muench法计算TCID50值。
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