2.2没食子酸对腐败希瓦氏菌生长曲线和杀菌曲线的影响
腐败希瓦氏菌的生长曲线见图1(a)，整个培养期，对照组的腐败希瓦氏菌菌数呈逐渐增长趋势，经历了延滞期、指数生长期和稳定期。而1.25 mg/mL(MIC)没食子酸处理组没有明显增长的趋势，不能进入对数生长期。表明在此浓度下，腐败希瓦氏菌的生长被完全抑制。时间杀菌曲线如图1(b)所示，腐败希瓦氏菌培养过程中，对照组活菌数呈明显的上升趋势，经历了延滞期、指数生长期和稳定期，与生长曲线一致。没食子酸处理组的活菌数呈现下降趋势，表明此浓度下的没食子酸具有一定杀菌活性。结合生长曲线与杀菌曲线可说明，没食子酸在1.25 mg/mL(MIC)浓度下，活菌数量逐渐减少，能完全抑制腐败希瓦氏菌的生长。
图1食子酸对腐败希瓦氏菌的生长曲线和时间杀菌曲线
2.3没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞形态的影响
通过SEM观察1.25 mg/mL(MIC)没食子酸处理前后腐败希瓦氏菌细胞的形态变化。如图2(a)所示，对照组的腐败希瓦氏菌菌体完整饱满，菌体表面没有破损。而经没食子酸[图2(b)]处理细菌形貌发生变化，细胞破裂，扭曲变形，一些部位开始凹陷。可能是细胞膜破损造成细胞内容物的大量泄露，从而使细胞明显变形，粘连在一起。结果表明，没食子酸可引起腐败希瓦氏菌细胞的破损和变形，严重影响细胞正常生长，甚至造成细胞死亡。没食子酸分子结构中的酚羟基可能是其产生抑菌作用的活性基团，与细菌细胞膜上的蛋白质、脂类等发生反应，改变细菌细胞膜通透性，从而破坏细胞膜的完整性，导致细菌细胞形变。
图2没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞形态的影响
2.4没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞凋亡的影响
流式细胞图分为4个区域，LL区为细胞存活，LR区为早期凋亡，UR区为晚期凋亡，UL区为细胞坏死。图3(a)为对照组流式细胞分析结果，LL区细胞存活率高达96.1%，细胞坏死率为2.5%，早期凋亡率和晚期凋亡率分别为0.6%和0.8%。由此可见，未经处理的细菌存活率非常高。经MIC没食子酸[图3(b)]处理的腐败希瓦氏菌，存活率达到78.6%，细胞坏死率为20.8%，早期凋亡率和晚期凋亡率分别为0.0%，0.6%，坏死率显著高于对照组。较对照组相比，经没食子酸作用后的腐败希瓦氏菌的凋亡率明显增大，可能是没食子酸能够破坏细胞壁膜结构，使细胞膜通透性增大。
图3没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞凋亡的影响
2.5没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞膜完整性的影响
经没食子酸处理的腐败希瓦氏菌细胞中蛋白及核酸泄漏情况用于反映细菌细胞膜完整性的变化。图4(a)是1.25 mg/mL(MIC)没食子酸处理的腐败希瓦氏菌菌悬液在260 nm下的吸光值。对照组的OD260 nm为0.526，经没食子酸处理后的腐败希瓦氏菌菌悬液的OD260 nm达到1.024，显著高于对照组，表明没食子酸处理引起腐败希瓦氏菌核酸的外泄。对照组腐败希瓦氏菌菌悬液中总蛋白浓度为3.689 mg/mL，没食子酸处理后的蛋白浓度明显增加至15.841 mg/mL，表明没食子酸处理引起腐败希瓦氏菌蛋白的外泄。以上结果说明腐败希瓦氏菌的膜结构被破坏，导致细胞的内容物渗漏，进一步影响了菌体的代谢与生长。这可能是因为没食子酸具有较强的抗氧化性能，酚羟基能够提供质子，直接吸附于细胞，打破菌体原有的保护屏障，从而导致胞内物质的泄漏增加。
图4没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞完整性的影响
图5没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞膜通透性的影响
2.6没食子酸对腐败希瓦氏菌细胞膜通透性的影响
测定1.25 mg/mL(MIC)没食子酸处理对腐败希瓦氏菌菌悬液电导率的变化，进而分析对细胞膜通透性的影响(图5)。前60 min，各组电导率均有所增加，对照组电导率从13.46 mS/cm升至15.32 mS/cm，没食子酸处理组腐败希瓦氏菌菌悬液电导率从13.46 mS/cm迅速增加至16.91 mS/cm，其电导率显著高于对照组。60 min后，随着时间的延长，各组电导率趋于稳定。这一趋势与Li等的研究结果相似，其研究发现ε-聚赖氨酸处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的电导率在培养前45 min下显著增加。结果表明，没食子酸处理使菌体的细胞膜通透性增加，导致胞内大量的电解质泄露至培养液中，电导率增加，这会影响其正常代谢，最终导致死亡。
3结论
没食子酸、原儿茶酸和绿原酸对腐败希瓦氏菌均具有较好的抑制作用，其中没食子酸对腐败希瓦氏菌的抑制作用更强，其最小抑菌浓度为1.25 mg/mL。1.25 mg/mL(MIC)没食子酸处理引起腐败希瓦氏菌细胞形态的改变，细胞膜完整性破坏，细胞膜通透性增大，核酸、蛋白质等大分子大量泄漏，致使细菌细胞凋亡率增加。没食子酸是一种具有潜在应用前景的水产品保鲜剂，后续研究可考虑探究没食子酸在水产品保鲜中的应用。
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