1.2.3菌落PCR鉴定
以菌落为模板，采用2×Phanta®Max Master Mix（Dye Plus）酶进行菌落PCR鉴定。反应体系为：灭菌蒸馏水8.5 mL，2×Phanta®Max 12.5 mL，菌液模板2.0 mL，上下游引物各1.0 mL，共25.0 mL。反应条件为：94℃2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，30个循环。
1.2.4病毒拯救
在转染前1 d，将铺满单层90%以上的BHK-21细胞铺于6孔细胞培养板中，将菌落PCR鉴定正确的SVA重组质粒通过脂质体Lipofectamine 3000按照试剂盒建议的试验方案进行转染，同时转染EGFP N2质粒观察转染效率，置于37℃含5%CO2的培养箱中培养，48 h后观察转染效率；成功转染的细胞反复冻融3次，8 000 r/min离心5 min收获上清，将上清重新接种于新的BHK-21细胞，盲传3代（F3），观察细胞病变情况，收集发生病变的细胞毒。
1.2.5拯救病毒鉴定
将拯救的病毒传至第5代（F5），收获病毒培养液，通过天隆DNA/RNA磁珠法全自动核酸提取试剂盒，采用HiScript®III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）进行反转录，同时清除DNA以排除转染质粒对测序结果的干扰。依据2017年广东SVA全基因序列（登录号：MG428683.1），设计7对引物（表2），能够扩增出部分重叠、覆盖SVA全基因组序列的7条片段。以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为：灭菌蒸馏水19 mL，2×Phanta®Max 25 mL，cDNA模板2 mL，上下游引物各2 mL，共50 mL。反应条件为：94℃2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，30个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳阳性条带切胶后送生工生物技术公司测序。
表2拯救病毒鉴定用引物序列
1.2.6生长曲线分析
将传至第5代的拯救毒株与亲本毒株（MOI=0.1）分别接种铺满单层BHK-21细胞的96孔板中，每种毒株3次重复，吸附1 h，PBS洗涤2次，加入含2%胎牛血清的培养液继续培养。在接种后6、12、18、24 h分别收获病毒，测定不同时间点病毒TCID50，绘制病毒生长曲线，比较拯救毒株与亲本毒株的增殖特性。
1.2.7间接免疫荧光试验
在12孔板中接种BHK-21细胞，待细胞生长至90%，分别接种rSVA与亲本毒株（MOI=0.1），同时设置阴性对照；接毒18 h后，以4%冰冷多聚甲醛固定细胞10 min；PBS洗涤3次后用5%BSA溶液封闭，孵育特异性SVA一抗（针对VP2蛋白），PBS洗涤后孵育FITC标记的二抗，在荧光显微镜下观察结果。
1.2.8噬斑形成试验
将拯救毒株与亲本毒株样品连续10倍稀释后分别接种BHK-21细胞，放置于37℃5%CO2培养箱中感染1 h；弃去病毒液，用PBS洗涤细胞2～3次；将低熔点琼脂糖与2×DMEM（体积比为1:1）混合后以2 mL/孔加入6孔板中，继续培养2～3 d；在显微镜下观察，当产生明显噬斑后用4%甲醛溶液固定细胞3 h，每孔加入0.5 mL 1%结晶紫室温染色0.5 h；水洗去染色液，进行噬斑形态观察。
2结果
2.1 SVA感染性克隆构建策略
SVA基因组全长较短，仅7.3 kb，可采用高保真酶一步法扩增。同时几个基因元件扩增引物设计好同源臂，使pWSK-29载体5'端到3'端依次重组进CMV、SVA全基因组、poly（A）+HDVr（图1）。
图1 pWSK-29-SVA感染性克隆示意图
2.2 SVA全基因组及相关基因片段PCR扩增
如图2所示：以SVA-GXT91 RNA为模板扩增出长度约为7.3 kb的SVA病毒基因片段；以引物为模板，通过退火自结合方式扩增出了poly（A）+HDVr；以EGFP N2质粒为模板，扩增出了CMV启动子。
图2 SVA全基因组与poly（A）+HDVr、CMV片段PCR扩增结果
2.3同源重组及菌落PCR鉴定
将pWSK-29质粒经SacI/HindIII双酶切线性化，在同源重组酶ExnaseMulitS催化下，将CMV启动子、SVA全基因组、polyA+HDVr依次重组进pWSK-29载体，构建出pWSK-29-SVA重组质粒。将重组质粒pWSK-29-SVA转化至感受态细胞，过夜培养后，利用鉴定引物对菌落进行PCR鉴定并测序。经鉴定，所构建的SVA感染性克隆质粒完全符合预期设计（图3）。
图3 pWSK-29-SVA菌落PCR鉴定结果
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