1.2.2菌株的初步鉴定
1.2.2.1形态学观察
将菌株接种到固体培养基上，放置在30℃的恒温培养箱中培养20 h，肉眼观察菌落的形状、大小、隆起度、边缘透明度与颜色等培养特征。在普通光学显微镜下难以看清细菌的形状和结构，因此，需要通过革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色和鞭毛染色等方法，将菌体染上颜色，从而借助颜色的反差作用观察菌体形态。经染色后利用光学显微镜观察革兰氏染色、形状、荚膜、芽孢以及鞭毛等菌体形态。
1.2.2.2生理生化鉴定
主要选择了糖或醇类发酵试验(葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖)、温度生长范围、pH生长范围、需氧性试验、硝酸盐还原、吲哚试验、硫化氢产生、明胶水解、酪素水解、淀粉水解、酪氨酸水解、耐盐性试验、过氧化氢酶的测定、卵磷脂酶的测定、甲基红试验、V-P试验、石蕊牛奶反应、溶菌酶抗性试验以及在pH 5.7的营养肉汤上的生长等19项试验进行检测，具体试验方法参照《微生物学实验手册》和《微生物学实验技术》。
1.2.3细菌16S rDNA鉴定
将细菌16S rDNA鉴定的通用引物作为上下游引物，以提取的菌株总DNA为模板进行PCR扩增。20μL PCR反应体系：ddH2O 13.7μL，10×Ex Taq buffer 2.0μL，5u Ex Taq 0.2μL，2.5mM dNTP Mix 1.6μL，上游引物(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)1μL，下游引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)1μL，DNA模板0.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，该步骤循环25次，最后72℃延伸10 min，于4℃冰箱保存。在进行DNA测序之前，检测PCR是否扩增成功。取2μL PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后，用凝胶成像仪检测。将PCR扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA测序。利用BLAST软件，将测得的序列与GenBank中已知序列进行比对，通过MEGA6.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。
1.2.4生长曲线的测定
细菌的生长要经过迟缓期、对数期、稳定期和衰退期四个阶段。在对数生长期，细菌生长速率最快，对碳源的利用率也最高。因此，测定菌株的生长曲线，将对数生长期内的菌种制备成种子液，用于苯酚降解实验。挑取两个单菌落接种到富集培养基中，32℃、180 r/min放入全自动微生物生长曲线分析仪振荡培养30 h。以未接种的富集培养基做空白对照，在600 nm波长下，每四小时测定OD值，以检测细菌浓度。为减少误差，取两组平行实验的平均值绘制生长曲线。
1.2.5菌株的降酚特性
将平板上的单个菌落接种到富集培养基中，培养至对数生长期，制成菌悬液。筛选菌株Y_1时，发现该菌在苯酚浓度1 100 mg/L时能良好生长。因此，将菌株在苯酚浓度1 100 mg/L、pH 7.0～7.2、接种量4%、温度32℃、摇床转速180 r/min的条件下振荡培养，以不含苯酚的无机盐培养基为空白对照，采用4-氨基安替吡啉直接分光光度法[34]测定苯酚浓度。在相同条件下进行三组平行试验，取三组读数的平均值。依据苯酚标准曲线，计算出苯酚的降解率。
苯酚降解率计算公式：苯酚降解率=(接种前的苯酚浓度-生长消耗剩余的苯酚浓度)/接种前的苯酚浓度×100%
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