茯砖茶发源于泾阳,属于六大茶类中的黑茶,其主要区别于其他黑茶的特征就是茶砖内部长有“金花”,“金花”是由散囊菌属产生的闭囊壳。茯砖茶能够消食解腻,深受大众喜爱.古时流传有“非泾阳之水不能制茯茶”之说.茯砖茶生产的关键在于其“发花”工艺,“金花菌”对于茯砖茶品质形成起着至关重要的作用。“金花菌”能够降低原料茶的苦涩味,增加其醇和感,并且能够产生水溶性色素以及多种香气成分,以形成茯砖茶独有的风味,并促进其品质的形成.目前研究表明,温度、湿度是控制“发花”的最主要因素;但是关于水质如何影响“金花菌”的生长,进而影响茯砖茶的品质,还尚未有结论。
调研证实,泾阳地区地下水以微咸水为主,泾河流域地下水中阳离子浓度最高的为Na+、Ca2+、Mg2+,平均浓度高于黄河及长江等内陆河流域及全球河流,且生产企业多以地下水加工茯砖茶.水中的这些离子对“金花菌”生长有何影响,其机制还尚不明确。
为探究“金花菌”对于高渗培养条件的生长适应,本研究从茯砖茶中分离“金花菌”,并采用形态学结合分子生物学技术进行鉴定.选择典型的2株“金花菌”对其在NaCl模拟高渗条件的下的生长特性进行研究。本研究对于揭示“金花菌”适应较高盐度的生长机制,为进一步明确茯砖茶品质形成的作用机理,提高茯砖茶品质奠定坚实基础.
盐离子对“金花菌”生长的影响
“金花菌”在40%蔗糖蛋白胨培养基上培养4天菌落直径约为3.8 cm.在添加了0.5%~22.5%的NaCl的40%蔗糖蛋白胨培养基上,“金花菌”均能够生长.“金花菌”在NaCl浓度较低的情况下形成较多黄色闭囊壳,菌落中心呈黄色,外部边缘为白色绒毛状菌丝,但是随着NaCl浓度的增大,在萌发后先产生大量茂盛的白色菌丝体,其菌落呈灰绿色,随着菌的不断生长,开始逐渐形成黄色闭囊壳.在添加0.5%~15.5%的NaCl培养基中培养4天,菌落直径如表1所示.
两株“金花菌”均在添加4.5%NaCl的培养基上菌落直径最大,生长最好,J-2的菌落直径为4.53 cm,而F-2的菌落直径达到4.82 cm.随着培养基中NaCl含量的升高,“金花菌”生长受到抑制,其菌落直径也随之减小.虽然高浓度NaCl抑制“金花菌”萌发,但2株“金花菌”在高糖高盐培养基上仍能很好生长(如图7所示).与“金花菌”对比,黑曲霉在添加0.5%~15.5%NaCl的平板上可以生长,但当NaCl添加量达到11.5%时,其生长受到抑制,萌发时间延长.青霉在含NaCl平板中生长受限,当NaCl含量达到8.5%时,菌株未萌发.
(a)16.5%NaCl F-2形态(b)16.5%NaCl J-2形态
“金花菌”能够耐受一定浓度的CaCl2和MgCl2,Mg2+一定程度上可促进“金花菌”生长,并且其他研究证实,镁离子能够促进真菌菌体生长。通过对泾阳地表水和地下水中化学成分的分析,Na+和Mg2+为主控阳离子.适量NaCl会促进“金花菌”生长,随着NaCl含量的增加,会推迟“金花菌”萌发时间.
表1不同NaCl浓度40%蔗糖蛋白胨培养基上F-2和J-2菌落直径
将茯砖茶中分离出的黑曲霉、青霉同“金花菌”同时接于不同浓度NaCl含量的平板上,发现当NaCl含量达到8.5%时,青霉不能生长,而当NaCl浓度达到15.5%时,黑曲霉生长已经受到极大抑制,当NaCl含量增至22.5%时,“金花菌”仍然能够生长.一方面高浓度的NaCl能够抑制其他杂菌生长,另一方面“金花菌”能够耐受高浓度NaCl,因此水中高浓度NaCl有利于茯砖茶“发花”而不受到杂菌污染.
高渗条件对“金花菌”的生殖方式的影响
“金花菌”在高渗培养基上,气生菌丝生长茂盛,随后形成球型顶囊(如图8(a)所示),在顶囊上长出单层小梗(如图8(b)所示),逐渐发育,在分生孢子梗上产生分生孢子(如图8(c)、(d)所示).“金花菌”在70%蔗糖CZG培养基上及在高盐浓度的40%蔗糖蛋白胨培养基培养的过程中,开始先进行无性生殖,随着培养时间的延长,逐渐进行有性生殖.
(a)球型顶囊(b)顶囊长出单层小梗
“金花菌”在处于胁迫环境时可以通过选择生殖方式以适应环境.“金花菌”常规培养条件下均进行有性生殖.在高盐高糖诱导下,“金花菌”改变生殖方式,进行无性生殖,产生分生孢子,无性生殖是一种较低级的生殖方式.通过观察发现随着NaCl含量的升高,“金花菌”产生灰绿色分生孢子头进行无性生殖.有研究发现在平板中添加3 M的NaCl会使“金花菌”只进行无性生殖,在本研究中,当NaCl添加量为18.5%时,仍然存在有性和无性两种生殖方式,可能是由于选用的培养基不同,营养状态不一致导致.在极端环境时,首先菌丝生长进行营养增殖,选择较为简单的无性繁殖方式产生分生孢子,随后再进行有性生殖,产生子囊孢子.“金花菌”主要进行有性生殖,使其能够耐受逆境.在胁迫环境下,“金花菌”子囊果、子囊对子囊孢子形成重重保护,使其能够耐受较高的渗透压,在条件适宜时又会重新萌发.“金花菌”的子囊孢子结构较分生孢子更稳定,分生孢子在外力作用下发生变形,甚至破裂,而子囊孢子几乎无变化.“金花菌”不仅存在结构优势能够适应逆境,同时存在一些抗逆基因,能够有利于其对抗胁迫,在一些研究中发现谢瓦散囊菌(A.chevalier)中分离出GDH基因能够有利于水稻耐干旱胁迫。
“金花菌”在茯砖茶的生产过程中是优势菌,具有极强降解能力,但在其他行业中,如制糖工业,烟业中,“金花菌”却是一种污染菌,通过本研究对“金花菌”对各种离子的耐受以及耐高渗特性的揭示,更有利于“金花菌”在茯砖茶生产中的应用及在其他行业中的控制,为工业中有效利用和控制“金花菌”奠定基础.
结论
茯砖茶中分离出两株“金花菌”F-2和J-2分别与Aspergillusintermedius和肋状散囊菌(Aspergilluscostiforme)具有高度相似性.2株“金花菌”能够在22.5%的NaCl和10.5%的CaCl2和MgCl2培养基上能够生长,且MgCl2的添加对“金花菌”的生长具有明显促进作用.“金花菌”能够耐受70%蔗糖浓度,在高糖、高盐模拟的高渗条件下,“金花菌”气生菌丝生长旺盛,产生灰绿色分生孢子头,进行无性生殖.“金花菌”极可能通过选择生殖方式对抗高渗胁迫,其有性生殖产生的子囊果结构更能抵抗不利环境.