依照现有的培养技术和方法,不同生境微生物可培养率的检测结果如下:海水中约为0.001%~0.1%,淡水中约为0.25%,土壤中约为0.3%,活性污泥中约为1%~15%。为了克服现有培养技术方法的局限性,研究人员在提出改进现有微生物培养措施的同时,相继开发出一系列新的微生物培养方法和技术,如稀释培养法和高通量培养法、扩散盒培养法以及细胞微囊包埋技术等,大大提高了微生物培养的数量和种类,对微生物资源的开发及利用具有重要意义。


目前,实验室使用的常规培养基多为高浓度营养基质。事实上,有研究发现低浓度基质培养出的细菌数量和种类均多于高浓度基质。但浓度过低也会降低微生物的培养数量,最适宜的浓度最好与自然界中微生物生长的环境条件相近。例如,在培养土壤微生物时加入土壤浸提液、培养海洋微生物时加入含有少量生长因子的天然海水,可以大大提高所培养微生物的数量及种类。还可通过减少培养环境中的氧分压、以多聚物为碳源、在培养过程中加入可降解毒性氧的物质等,不同程度地减弱毒性氧的毒害作用。另外,以下措施也可有效提高微生物的培养几率。如,通过适当延长培养时间,有可能使某些“寡营养菌”肉眼可见,但培养时间越长,对培养环境的无菌要求就越高,因此培养时间不能无限延长;用古兰糖胶作为培养基固化剂,可以避免琼脂对某些微生物的毒性作用,增加微生物的可培养性;在微生物培养过程中,供应微生物所需的特有底物(如电子供体和受体),可有助于微生物的正常生长,从而可能发现未知的生理型微生物。


实验室微生物培养方法

根据培养时是否需要氧气,可分为好氧培养和厌氧培养两大类。


(1)好氧培养:也称“好气培养”。这种微生物在培养时,需要有氧气加入,否则就不能生长良好。


在实验室中,斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。


三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡,使外界的空气源源不断地进入瓶中。


(2)厌氧培养:也称“厌气培养”。这类微生物在培养时,不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中,最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法:


a.降低培养基中的氧化还原电位:常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等,加入到培养基中,便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中,也可适合厌氧菌的生长。


b.化合去氧:这也有很多方法,主要有:用焦性没食子酸吸收氧气;用磷吸收氧气;用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气;用植物组织如发芽的种子吸收氧气;用产生氢气与氧化合的方法除氧。


c.隔绝阻氧:深层液体培养;用石蜡油封存;半固体穿刺培养。


d.替代驱氧:用二氧气碳驱代氧气;用氮气驱代氧气;用真空驱代氧气;用氢气驱代氧气;用混和气体驱代氧气。


根据培养基的物理状态,可分为固体培养和液体培养两大类。


(1)固质培养:是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中,在合适的条件下进行微生物培养的方法。


(2)液体培养:在实验中,通过液体培养可以使微生物迅速繁殖,获得大量的培养物,在一定条件下,还是微生物选择增菌的有效方法。


新型微生物培养技术


稀释培养法和高通量培养法


由于海洋环境中主要是寡营养微生物类群,迄今为止海洋环境中可以培养的微生物的比例仍是地球环境中最低的,因此在人工培养时,它们就会受到来自同一环境中处于生长优势的微生物的抑制而不能生长。稀释培养法认为,当把海水中微生物群体稀释至痕量(103/mL)时,在海水中主要存在的寡营养微生物可不受少数几种优势微生物竞争作用的干扰,因而主体寡营养微生物被培养的可能性会大大提高。研究人员在稀释培养法的基础上又研究出高通量培养法,即将样品稀释至痕量后,采用小体积48孔细胞培养板分离培养微生物。该方法不仅有效提高了微生物的可培养性,还可在短期内监测大量的培养物,大大提高了工作效率。


扩散盒培养法


扩散盒是Kaeberlein等在分离培养潮间带底泥微生物时使用的一种自制培养仪器,其最大的特点是有效地保证了微生物群落间作用的存在,可比较真实地模拟微生物所处的自然环境,提高微生物可培养性。应用此种改进技术,研究者从环境样品中分离出许多常规方法很难分离的微生物。应当指出,扩散盒技术初次培养获得的微小菌落多数为混合培养,通常需要再次分离,才能获得纯培养。该种方法的特点是:模拟自然环境,不同细胞间经过互喂形成独立的菌落。扩散盒法的主要不足是操作比较繁琐。


细胞微囊包埋技术


细胞微囊包埋法是近年来出现的一种将单细胞包埋培养与流式细胞仪检测结合为一体的高通量分离培养技术。Zengler等先将土壤样品中的微生物进行稀释,与融化的琼脂糖混合,然后在专门的搅拌器中用油乳化,形成直径30~50μm的微滴,其中10%的胶滴会含有单个细胞。之后,将包埋胶囊装入层析柱内,层析柱进口端用0.1μm滤膜封住,防止外部细菌的进入而污染层析柱,出口端用8μm滤膜封住,低浓度的有机物培养液连续通过层析柱对包埋胶囊进行流态培养,未被包埋的游离细胞则随培养液流出柱外。结合流式细胞仪进行检测,将长有单菌落的胶囊分选到加有丰富培养基的96孔板中继续培养,最终获得纯培养微生物。该种高通量的培养技术可从每个样品中分离出10000多株细菌和真菌。Ben-Dov等研究出一种双层包埋技术,先将微生物包装在琼脂球内,外面用一种多羰基高分子膜包裹,将这种双层包裹的小球放在一种雌性石芝珊瑚的表面黏液层中培养,获得许多新的微生物,与已知细菌序列比较,最大相似性只有85%~96%。Nichols等设计了一种高通量的微生物分离芯片(Ichip)方法,每个芯片包含有数百个微型扩散孔,每个扩散孔只含有一个微生物细胞。采用该种芯片装置,分离到大量的海水和土壤微生物,其中序列最大相似性小于95%的新种分别占28.3%和28.7%。细胞微囊包埋法的优点:在接近于天然生长的环境中有效地提高了微生物的可培养性。


总结:近年来,新颖的微生物培养方法和技术陆续问世,大体可归纳为两类:一是在传统的培养基组成和培养方式上进行改良,包括添加微生物相互作用的信号分子,供应新型的电子供体和受体,降低营养基质浓度,延长培养时间以改善微生物的培养条件,促进低营养以及寡营养微生物种类的分离培养等;二是设计仿原生境的高通量微生物培养技术和装置,如用于海洋环境和陆生环境的扩散盒技术、土壤基质膜技术以及高通量的细胞微囊包埋技术等。这些技术的研发极大地丰富了可培养微生物种群多样性的资源宝库,并为开发这些微生物资源奠定了良好的研究基础。然而,由于微生物生存环境极其复杂,未培养微生物数量巨大,种类繁多,因此,在探索微生物学领域的过程中仍面临着巨大的挑战。


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