GtfB和GtfC在结构化三维基质组装中的作用
图3 GtfB和GtfC在结构化三维基质组装中的作用。
(A) 由变形链球菌UA159（亲本株）或ΔgtfBC突变株形成的混合菌种生物膜的代表性三维共聚焦图像。生物膜在1%（w/v）蔗糖存在下生长115小时。胞外多糖显示为红色，细菌细胞显示为绿色。比例尺位于左下角。右侧面板显示了左侧选定区域的特写视图。(B) 变聚糖酶（α-1,3葡聚糖酶）处理对胞外多糖基质结构完整性的影响。上图：未经处理的生物膜（对照）；下图：在91小时时用变聚糖酶处理并在115小时时成像的生物膜。左侧面板显示了三维渲染图；右侧面板显示了COMSTAT分析得出的生物量和微菌落体积数据。数据为平均值±标准差（n=10）。星号(*)表示与对照组有显著差异（P<0.05）。比例尺=50 μm。
通过基因敲除研究进一步探讨了GtfB和GtfC协同作用在生物膜基质形成和结构组织中的影响。同时缺失 gtfB 和 gtfC 显著损害了突变株在sHA表面组装胞外多糖层或进一步合成三维富含胞外多糖基质的能力。该突变株也无法在sHA表面形成胞外多糖-微菌落复合体（与亲本株变形链球菌UA159存在下的混合菌种生物膜相比；图3A）。特写图像显示主要是细胞间的共聚集（类似于在1%葡萄糖组中观察到的）。COMSTAT和DUOSTAT分析证实不存在任何可检测的微菌落结构，总体生物膜生物量减少，并且几乎完全没有胞外多糖（数据未显示）。
单独缺失每个基因在磷灰石表面产生了不同的胞外多糖和细菌积累模式。当使用 gtfB 无效突变株形成生物膜时，检测到了初始胞外多糖层，但胞外多糖-微菌落复合体的组装完全被废除。相比之下，当在系统中使用 gtfC 无效突变株时，初始胞外多糖层的形成受到严重损害，而在sHA表面检测到少数小的微菌落（与含有UA159的生物膜相比）（可能仍与功能正常的 gtfB 有关）。
由GtfB（特别是）和GtfC产生的表面形成的葡聚糖富含 α-1,3-连接葡萄糖，赋予其高度不溶且结构刚性的聚合物特性，这可能对构建三维基质结构至关重要。我们研究了消化 α-1,3 糖苷键是否会冲击胞外多糖基质和胞外多糖-微菌落复合体的结构完整性。在生物膜形成后引入变聚糖酶（α-1,3 葡聚糖酶；EC 3.2.1.59），基本上导致了基质结构的崩溃（图3B）。不溶性葡聚糖的缺失或移除瓦解了基质的框架，而细胞相关的葡聚糖结合蛋白可以在此框架上原位结合。因此，缺乏不溶性葡聚糖消除了任何结构性的细胞-基质桥接，导致胞外多糖-微菌落解体（见图3B中选定区域）。COMSTAT分析也证实，变聚糖酶处理后，生物膜的细胞和胞外多糖成分的生物量都大幅减少（图3B）。数据清楚地表明，α-1,3-连接的葡聚糖（仅存在于GtfB以及较小程度上的GtfC衍生的葡聚糖中）对于三维基质和微菌落的结构完整性至关重要；这一观察结果与遗传学研究的结果一致。
GtfB和GtfC衍生多糖的位置可能调节基质的顺序组装。每种分泌的Gtfs都以酶活性形式结合到特定的表面。GtfC对获得性膜的亲和力最大，而GtfB优先结合微生物表面。由GtfC合成的葡聚糖组装了sHA表面的初始胞外多糖层，这为变形链球菌提供了增强的结合位点。由GtfB形成的高度不溶、分支且结构刚性的葡聚糖（富含 α-1,3 键）包裹细胞，有助于胞外多糖基质的支架构建。此外，Gtfs可以结合自身产生的葡聚糖，影响基质在原位的进一步生长。胞外多糖和细菌细胞的局部积累通过混合菌种生物膜内的细胞-基质粘附介导了三维胞外多糖-微菌落复合体的构建。因此，在内氏放线菌和口腔链球菌存在下，变形链球菌 gtfB 和 gtfC 表达的增强（图2B-D）可以解释为什么混合菌种生物膜中形成的微菌落大小比单菌种生物膜中的更大。
根据使用完善的啮齿动物龋病模型确定，缺失 gtfB 和/或 gtfC 基因的突变体在体内基本上是无毒力的。此外，用针对细胞相关GtfB（能抑制酶活性）的鸡蛋源性抗体进行治疗，显著减少了大鼠龋损的发展。这些观察结果表明了胞外多糖合成在生物膜毒力表达中的重要性。然而，这种现象如何与三维胞外多糖基质的组装相关联，以及它与细菌细胞的空间排列如何，仍有待阐明。早期的研究仅使用了简单的细胞标记方法。
胞外多糖与细菌细胞在三维胞外多糖-微菌落复合体构建过程中的空间排列
图4 混合菌种生物膜形态发生过程中胞外多糖与细菌细胞的空间排列。
(A) 在1%（w/v）蔗糖存在下，于不同时间点（29、43、67、91和115小时）形成的混合菌种生物膜的代表性三维共聚焦图像（顶部一行）和相应的横截面图像（底部四行）。胞外多糖显示为红色，细菌细胞显示为绿色。白色虚线表示sHA表面的位置。比例尺=50 μm。(B) 使用DUOSTAT软件计算的整个生物膜发育过程中与胞外多糖共定位的细菌细胞的百分比。数据为平均值±标准差（n=10）。
密集堆积的细菌小岛是通过细胞-基质相互作用随时间形成的。因此，我们检查了混合菌种生物膜形态发生过程中每个发育阶段的胞外多糖和细菌细胞的空间排列（图4）。使用相同的比例尺来展示随时间推移，胞外多糖介导的细菌聚集的三维演变（图4A）。每个时间点的横截面图像显示在图4Ab-m中。胞外多糖被检测到存在于（1）细菌细胞之间，（2）围绕，（3）覆盖，以及（4）填充微菌落之间的空隙，将它们桥接在一起并将其系留在sHA表面。
基于胞外多糖的位置，我们推测多糖介导的生物膜构建通过以下序列形成复杂的三维细菌小岛：初始粘附、细胞聚集（图4Ab-d）、形成由胞外多糖包裹的细菌细胞核心，该核心提供支持性框架以促进微菌落的建立（图4e-g）。从初始细胞聚集到微菌落形成的转变与铜绿假单胞菌生物膜中PsL介导的转变有一些相似之处。随着生物膜成熟，胞外多糖也包裹单个微菌落并似乎将其桥接（图4Ah-j），导致形成多个微菌落的聚集体（图4Ak-m）。计算分析结果显示，在115小时时，超过80%的总细胞与胞外多糖共定位（图4B），因为生物膜的主体部分越来越多地由多糖组成（与我们共聚焦图像一致）。我们提出，包裹在多糖中的单个微菌落可能充当结构单元，在生物膜构建过程中相互连接，形成分隔的网络，在三维结构中赋予高度异质但又内聚的环境。
细菌细胞与胞外多糖基质之间的粘附可能部分通过变形链球菌表达的细胞表面葡聚糖结合蛋白C以及可能的GbpB介导。分泌的GbpA和GbpD也可能结合并交联sHA表面和细菌表面的葡聚糖，从而有助于维持三维结构。此外，胞外DNA可能在胞外基质中发挥结构功能。eDNA增强变形链球菌的粘附和表面聚集，并可能通过与细菌细胞和胞外多糖结合而整合到富含胞外多糖基质的发育过程中，可能有助于微菌落的形成。
胞外多糖基质的组装改变了生物膜的三维结构，同时细菌种群动态地向变形链球菌（一种产生Gtf、结合葡聚糖且耐酸/产酸的病原体）的优势地位转变。与此同时，通过局部的细胞-基质粘附，在生物膜内的特定区域（结合在sHA表面和系留在基质上）形成了胞外多糖-微菌落复合体，而其他区域则缺乏此类结构。这种高度异质性的结构和各种细菌小岛的组装，特别是那些靠近sHA的小岛，可能创造出对生物膜毒力至关重要的生态和环境龛位。
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