结果/讨论
我们的结果说明了生物膜基质结构与混合菌种生物膜内微环境异质性之间的相互作用。富含胞外多糖的基质促进了完整生物膜内低pH值点状区域的形成，其中许多位于靠近磷灰石表面的地方。由此产生的环境有利于选择产酸、耐酸和结合葡聚糖的病原体（如变形链球菌），并在生物膜附着表面产生脱矿位点，从而从非毒性阶段转变为毒性阶段。
胞外多糖基质的三维组装
我们随时间推移检查了唾液包被的磷灰石盘上混合菌种生物膜的形态发生。我们重点关注三维结构的发育，这与胞外多糖在sHA表面的早期积累以及随后富含胞外多糖基质的构建有关。胞外多糖基质的形成和组装顺序受到测试系统中包含的糖类类型的显著影响（图1A）。引入1%蔗糖后，在sHA表面形成一层异质性的胞外多糖层，43小时后在胞外多糖表面观察到微生物的局部聚集（图1Ag；见箭头）。发育67小时后（图1Ah），细胞与胞外多糖紧密堆积，形成三维细菌结构（称为胞外多糖-微菌落复合体；在图1Ah中突出显示）。115小时后，这些细菌结构的大小在几个维度上都增加了；随着时间的推移，它们越来越多地被胞外多糖基质包裹和包围（图1Ai）。观察到两种不同位置的胞外多糖-微菌落复合体：那些附着在sHA表面形成的胞外多糖层上的（图1Ah），以及那些系留在基质主体上，靠近流体界面的（在图1Ai中突出显示）。这些在测试系统中蔗糖充足（1%）时的观察结果，与蔗糖受限（0.1%）或完全被葡萄糖替代时的情况形成鲜明对比。在用0.1%蔗糖形成的生物膜中，检测到sHA表面有一薄层胞外多糖，以及一些小的胞外多糖附着的微菌落（后期）（图1Ad-f）。当存在1%葡萄糖时，既没有组装出胞外多糖层，也没有组装出三维细菌小岛。相反，观察到一层薄而大部分均匀的细菌细胞层粘附在sHA表面（图1Aa-c）。特写图像显示，缺乏胞外多糖基质的聚集细胞的结构组织主要基于细胞间的结合（共聚集）。
图1 胞外多糖基质在混合菌种生物膜三维结构发展中的作用。
(A) 使用共聚焦显微镜获得的代表性三维图像，显示了在含有不同碳水化合物源的培养基中，于唾液包被的磷灰石（sHA）表面形成的混合菌种生物膜中胞外多糖（红色）和细菌细胞（绿色）的时空分布。白色箭头表示初始的局部细菌聚集。黄色箭头表示系留在基质主体上的胞外多糖-微菌落复合体。每个面板左下角显示的是比例尺，而合并图像中每个小方框的放大（特写）视图位于每个面板的右上角。(B) 数据为平均值±标准差（n=30）。星号()表示1%蔗糖组中的每个值（胞外多糖和细菌生物量）均与其他组有显著差异（P<0.05，Tukey-Krammer HSD检验）。(C) 细菌种类[变形链球菌（10² CFU/ml）、内氏放线菌（10⁶ CFU/ml）和口腔链球菌（10⁷ CFU/ml）]被接种到补充有0.1%（w/v）蔗糖的培养基中，培养至29小时以建立初始生物膜群落[口腔链球菌（5.6±3.5x10⁶ CFU）、内氏放线菌（9.4±6.5x10⁴ CFU）和变形链球菌（8.8±2.5x10³ CFU）]。然后通过引入1%（w/v）蔗糖（B-2）或1%（w/v）葡萄糖（B-3）来挑战生物膜的环境变化。随时间记录从生物膜中回收的变形链球菌、口腔链球菌和内氏放线菌的活菌数量（每个生物膜回收的CFU数），并根据CFU数据计算每个时间点每种菌株的比例。115小时时的微生物种群为：1%蔗糖（1.1±0.2x10¹¹ CFU变形链球菌；2.1±2.9x10⁹ CFU口腔链球菌；1.7±0.4x10⁷ CFU内氏放线菌），0.1%蔗糖（6.7±0.8x10⁹ CFU变形链球菌；1.4±1.9x10¹⁰ CFU口腔链球菌；9.3±1.3x10⁹ CFU内氏放线菌），和1%葡萄糖（2.6±1.9x10⁹ CFU变形链球菌；3.2±0.4x10¹⁰ CFU口腔链球菌）。数据为平均值±标准差（n=12）。星号()表示每种菌株的值彼此间有显著差异（P<0.05）。
1%蔗糖的存在也增加了生物质的生物量，这是由于富含胞外多糖基质的组装和三维结构的发展。在115小时时，蔗糖生长的生物膜比用1%葡萄糖形成的生物膜更厚，含有高达10倍以上的胞外多糖（以及更多的细菌生物量）（图1B；P<0.05）。当口腔链球菌和内氏放线菌在没有变形链球菌的情况下共同培养时，未能组装任何基质或胞外多糖包裹的微菌落，这揭示了变形链球菌及其产物在三维结构发展中所起的关键作用。
特定碳水化合物的可用性也会影响混合菌种生物膜发育过程中细菌种类的比例。在基线期，引入1%蔗糖之前，sHA表面的细菌细胞主要包括口腔链球菌和少量内氏放线菌细胞，变形链球菌是最不丰富的物种（P<0.05；图1C）。然而，1%蔗糖的引入（29小时时）产生了戏剧性的效果。变形链球菌的比例迅速增加，在115小时的生物膜中成为优势物种（图1B-2；P<0.05；CFU值见图例）。相比之下，在碳水化合物限制条件下（0.1%蔗糖），sHA表面上细菌种类的比例和数量是平均分布的（115小时终点，图1B-1；P>0.05）。引入1%葡萄糖（无蔗糖）导致在整个生物膜发育期间，种群以口腔链球菌为主（图1B-3；P<0.05）。
正如所料，生物膜周围培养基的pH值也随时间变化。引入1%蔗糖或1%葡萄糖后，培养基中的pH值彼此没有显著差异（最终pH 4.2至4.7），但低于含0.1%蔗糖（糖限制条件，pH 6.1至6.2）的培养基（P<0.05）（见表S1）。
引入1%蔗糖及其随后被变形链球菌代谢，诱导了从无毒力微生物群落（高水平的口腔链球菌和少量的变形链球菌）向高度产酸和耐酸种群的转变。这些数据揭示了表面胞外多糖产生的重要性，它为结合葡聚糖的病原体（如变形链球菌）提供了一个连续的粘附位点，同时生成了一个具有复杂三维结构的基质，可以创造独特的结构化低pH环境。
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