摘要
本研究报告了一株进化的、缺失三种终端氧化酶的大肠杆菌（Escherichia coli）突变株在有氧生长条件下将葡萄糖发酵为 D-乳酸。研究者将大肠杆菌 K12 MG1655 基因组中的细胞色素氧化酶基因（cydAB、cyoABCD 和 cbdAB）全部敲除，得到 ECOM3（E. coli cytochrome oxidase mutant）菌株。敲除细胞色素氧化酶使敲除菌株的摄氧率降低了近 85%。此外，该敲除菌株最初无法在 M9 最低培养基上生长。将 ECOM3 菌株在葡萄糖 M9 培养基上进行为期 60 天的适应性进化后，其生长速率达到了野生型大肠杆菌厌氧生长时的水平。研究结果表明，三个独立适应性进化的 ECOM3 群体获得了不同的表型：一个群体以乳酸作为唯一的发酵产物，而另外两个菌株在有氧生长条件下表现出混合酸发酵，且乳酸仍是其主要产物。该同型发酵菌株从葡萄糖合成 D-乳酸的得率为 0.8 g/g。研究者采用基因表达分析和基于计算机模型（in silico）的分析来鉴定受到扰动的代谢途径并解释表型行为。ygiN 和 sodAB 的显著上调解释了在进化后的 ECOM3 菌株中观察到的残余氧摄取。本研究构建的大肠杆菌菌株显示出将葡萄糖发酵产乳酸的能力，并能在有氧条件下进行混合酸发酵。
引言
大肠杆菌是代谢工程和代谢产物过量生产中最常用的宿主生物之一，这是因为它生长迅速、易于进行遗传操作，并且能够产生多种厌氧发酵产物（如有机酸）。大肠杆菌的代谢生理学研究也已相当深入，这使得基于理性模型的工程策略得以应用。旨在将特定代谢产物的过量产生与生长相偶联的大肠杆菌理性工程方法，结合适应性进化，已显示出菌株优化的潜力。对于将所需副产物分泌与生长相偶联的工程菌株，适应更高的生长速率已被证明可产物的产量增加。
大肠杆菌的厌氧生长特征是形成多种还原性副产物，即混合酸发酵，大多数代谢工程设计都依赖于缺氧生长条件。然而，维持严格的无氧条件是一项具有挑战性的任务，并使实验操作复杂化。
本研究的目标是开发一株在含氧与缺氧生长条件下表现出相似表型行为的大肠杆菌菌株。所得菌株可用作进化工程中的平台菌株，即在长期有氧条件下进行实验室进化，以优化所需的表型性状。
已有报道称，同时删除 cyd 和 cyo 基因可显著降低摄氧量，但并不能完全消除氧摄取。然而，尚未见对该突变菌株进行分泌分析或其他生理学鉴定的报道。基于这些结果，研究者假设：去除全部三种细胞色素氧化酶将使菌株即使在含氧条件下也表现出厌氧生长特征。此外，研究者预期负责混合酸发酵的厌氧途径将被激活，作为 NADH 再氧化的手段，从而产生发酵产物。
研究者对野生型大肠杆菌菌株（MG1655）进行了遗传操作，将其基因组中所有具有活性的细胞色素氧化酶全部去除。所得的 ECOM3（E. coli cytochrome oxidase mutant）菌株在进化过程中接受了适应性进化和表型鉴定。ECOM3 适应性进化的实验装置及本研究使用的命名法见图 1。对三个进化群体进行了全面鉴定，结果如下。
图 1. 整体实验设计与命名法。通过一系列遗传操作，将野生型大肠杆菌 K12 MG1655 菌株转化为亲本 ECOM3 菌株。从固体培养基中分离出 ECOM3 的单个克隆（菌落），并对其进行适应性进化（ECOM31、ECOM32 和 ECOM33），从而获得三个终点群体（eECOM31、eECOM32 和 eECOM33；“e”表示进化后的菌株）。完成表型表征后，鉴定出乳酸产量最高的菌株（eECOM31LA）
材料与方法
菌株与培养基
研究所有基因敲除均以大肠杆菌 K12 MG1655（ATCC 700926，购自美国典型培养物保藏中心）为出发菌株。在基因敲除过程中，必要时在 Luria-Bertani 培养基中添加 50 μg/ml 卡那霉素和 100 μg/ml 氨苄青霉素培养菌株。突变株的进化和表型评估使用 M9 最低培养基进行，以葡萄糖（2 g/L）为碳源，其中含 Na₂HPO₄·7H₂O（6.8 g）、KH₂PO₄（3 g）、NaCl（0.5 g）、NH₄Cl（1 g）、MgSO₄（2 mM）、CaCl₂（0.1 mM）及微量元素。在适应性进化的早期阶段，最低培养基中额外添加了 EZ 补充剂（Technova），其中含多种 L-氨基酸，浓度如下（括号内数值单位为 mM）：Ala 0.8；Arg 5.2；Asn 0.4；Asp 0.4；Cys 0.1；Glu 0.6；Gln 0.6；Gly 0.8；His 0.2；Ile 0.4；Leu 0.8；Lys 0.4；Met 0.2；Phe 0.4；Pro 0.4；Ser 10.0；Thr 0.4；Trp 0.1；Tyr 0.2；Val 0.6；腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶各 0.2；硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸和 2,3-二羟基苯甲酸各 0.01。
突变菌株的构建
本研究使用的所有菌株和质粒列于表 1。缺失三种已知细胞色素氧化酶的大肠杆菌 K-12 MG1653（ECOM3，即 ΔcydAB ΔcyoABCD ΔcbdAB 细胞色素氧化酶突变株）采用 λ Red 重组酶系统通过同源重组构建，所用引物列于补充材料的表 S1。简言之，待删除的基因被两侧带有 FRT 位点的卡那霉素抗性基因替换，随后用 FLP 重组酶切除该插入片段。删除顺序为：先删除 cydAB 操纵子，其次为 cyoABCD 操纵子，最后为 cbdAB；其中 cbdAB 操纵子删除后未用 FLP 重组酶切除抗性盒。为验证所有进化突变体的基因型，从固体培养基上挑取单菌落并用 PCR 检测，用于删除验证的引物列于补充材料的表 S1。同时以野生型大肠杆菌菌落作为阴性对照。
表 1. 本研究使用的菌株和质粒。| 菌株或质粒 | 相关特征 | 来源 |
|---|---|---|
| 菌株 | ||
| MG1655 | 大肠杆菌（野生型） | ATCC（目录号 700926） |
| ECOM3 | MG1655，Δ(cydAB appBC cyoABCD)::FRT-kan-FRT | 本研究 |
| ECOM3ygiN | MG1655，Δ(cydAB appBC cyoABCD ygiN)::FRT-kan-FRT | 本研究 |
| eECOM31 | 进化的 ECOM3 菌株 1（60 天） | 本研究 |
| eECOM32 | 进化的 ECOM3 菌株 2（60 天） | 本研究 |
| eECOM33 | 进化的 ECOM3 菌株 3（60 天） | 本研究 |
| eECOM31LA | 从 eECOM31 培养物中分离的最佳乳酸产生菌 | 本研究 |
| 质粒 | ||
| pKD46 | bla γβexo（Red 重组酶），温度条件型 pSC101 复制子 | 文献 |
| pKD13 | 带 FRT-kan-FRT（卡那霉素盒）的模板质粒 | 文献 |
| pCP20 | FLP⁺ λcI857⁺ λpR RepTS，Apr Cm | 文献 |