本研究通过拟南芥与小麦的比较磷酸化蛋白质组学，鉴定出去泛素化酶 UBP24 第360位丝氨酸（Ser360）为保守的高温响应磷酸化位点；该位点所在的 RxxS/T 基序在维管植物中高度保守，且其出现与气孔主动开闭的演化相伴。
图3、UBP24去泛素化并稳定AHA1，以促进气孔开放。a，来自UBP24过表达拟南芥转基因株的UBP24亲和力纯化后富集蛋白的火山图。黄色圆点表示与野生型幼苗亲和产物相比的所有显著候选蛋白。红色圆点表示根据基因本体论术语参与气孔运动调控的蛋白。y轴上的显著性由双尾学生t检验结合排列法计算的q值表示。b，21°C下在N. benthamiana叶片中，共表达裂解cYFP标记的GST或AHA1与nYFP–UBP24的代表性共聚焦图像。自由RFP用作表达对照。c，从N. benthamiana叶片中进行GFP陷阱共IP后，三组生物重复样本的代表性Western blot。d,e，通过HAtrap免疫沉淀富集N. benthamiana叶片中泛素化蛋白后，RFP–AHA1蛋白强度的代表性Western blot（d）及半定量分析（e）。使用3×HA–UBQ1作为泛素来源。ConcA为康康霉素A。
e，显示了三组生物重复样本中RFP–AHA1蛋白的强度。图中显示了双尾Mann-Whitney U检验的P值。f、g，代表性共表达酶失活UBP24(C206S)或UBP24(WT)与AHA1的共表达实验（使用N. benthamiana叶片）中的共聚焦图像（f）以及AHA1囊泡数量的定量结果（g）。在g图中，AHA1囊泡密度（每细胞囊泡数除以细胞面积）已进行对数变换。图中显示了双尾Mann-Whitney U检验的P值。n = 3个生物重复样本中的66个细胞。h、i，代表性共表达AHA1(WT)和泛素化缺陷型AHA1(5KR)在N. benthamiana叶片中的共聚焦图像（h）及AHA1囊泡数量的定量结果（i）。在i图中，AHA1囊泡密度（每细胞囊泡数除以细胞面积）已进行对数变换。j，21°C下拟南芥转基因系的代表性共聚焦图像。图像的颜色梯度表示RFP-AHA1荧光强度，从低到高由黑色和蓝色逐渐过渡为红色和白色。k,l，使用RFP抗体在21°C或35°C黑暗条件下处理1小时后，对拟南芥中AHA1蛋白进行Western blot（k）和半定量分析（l）。图l显示了三个生物重复中的AHA1蛋白强度。
图4、拟南芥UBP24同源基因负电荷的进化调控影响酵母高温应答。a，代表物种中拟南芥UBP24同源基因的氨基酸序列比对。b，酿酒酵母不同种类间Ubp3的进化比较图示。c、d，S. cerevisiae S288C中野生型与替换突变体Ubp3 E691A在不同温度下经42°C高温冲击处理后，生长曲线（c）及达到最大生长速率所需时间（d）。图c中的线条和阴影分别表示均值和标准误差。OD600为600 nm处的光密度。n分别为30°C、25°C和20°C时的3次、3次和5次生物学重复。e,f，Ubp3 USP 段在 MD 模拟轨迹（e）和稳态（f）中的总能量。在 f 中，字母表示双因素方差分析后的显著性，蛋白质 × 温度 P = 7.93 × 10⁻¹⁵，事后 Sidak 检验，来自三个技术重复中一个代表性技术重复的 701 个数据点。图 f 中的箱线图中心线代表中位数，箱体范围代表第一四分位数和第三四分位数，而茎秆部分代表 1.5 倍四分位距。
图5、在酿酒酵母中，Ubp3的缺失会导致高温胁迫后生长受抑。a,b 图显示了野生型（WT）和Ubp3敲除株S288C在不同温度下经高温胁迫处理后的生长曲线（a）以及达到最大生长速率所需时间（b）。图中的线条和阴影分别表示均值和标准误（SE）。图b中的圆圈和小尾巴/帽线分别表示均值和标准误（SE）。图b中显示的是双尾学生t检验的p值。n分别为30°C、25°C、20°C时的3次生物重复实验。
总结
表型分析显示，ubp24 突变体在42℃下气孔开放受阻，回补野生型 UBP24 或模拟磷酸化的 S360D 变体可恢复表型，而磷酸化缺陷型 S360A 不能，说明 Ser360 磷酸化是高温诱导气孔开放所必需的。
机制上，高温激活 B4 RAF 激酶，进而激活 OST1，由 OST1 直接磷酸化 UBP24 的 Ser360。该磷酸化引入的负电荷经分子动力学模拟与热位移实验证实，可提升 UBP24 USP 结构域的构象与热稳定性并抑制其降解，使 UBP24 在高温下积累。稳定后的 UBP24 发挥去泛素化酶活性，去除质膜 H⁺-ATPase（AHA1/2）的泛素化修饰，阻止其内吞降解，维持质子泵丰度与活性，驱动保卫细胞吸水膨胀、气孔开放以实现蒸腾降温。
值得注意的是，OST1 传统上介导 ABA 诱导的气孔关闭，本研究则揭示高温下其经 B4 RAF 激活后通过磷酸化 UBP24 转而促进气孔开放，体现了同一激酶在不同上游信号下的功能反转。跨物种比较发现，酿酒酵母同源蛋白 Ubp3 在对应位点以酸性氨基酸提供组成型负电荷，去除该负电荷后酵母热激后的生长与恢复能力显著下降，提示由负电荷调节去泛素化酶稳定性是植物与酵母共有的保守耐热机制。
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪提供高通量、无人值守、时间分辨率极高的连续生长动力学数据，直接输出 OD600 生长曲线。Bioscreen 在论文中承担的是"表型验证终端"的角色：它把植物里由磷酸化临时赋予的负电荷、与酵母里由酸性氨基酸固定赋予的负电荷，统一折算成可比较的细胞生长适应性读数，从而支撑了"负电荷调控去泛素化酶稳定性是植物与酵母共有的保守耐热机制"这一核心进化论断。
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