受胁迫的活和死革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞群的特征
在考虑食源性致病细菌的活和死细胞群时，我们还必须考虑在次优环境中存活的细胞，即受胁迫的细胞。过氧化氢已被用于模拟食品加工和食品保存过程中遇到的氧化胁迫条件。为了重现这种情况，革兰氏阳性无害李斯特菌和革兰氏阴性肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞在5毫摩尔过氧化氢中暴露2小时，用Archimedes进行评估。与上一节描述的方法类似，无害李斯特菌细胞在含有过氧化氢胁迫因子的BHI肉汤中监测，并在用Archimedes分析前在37°C下孵育90分钟，因为它们生长速率低。大肠杆菌细胞在含有过氧化氢胁迫因子的最小培养基中监测。5毫摩尔过氧化氢浓度的使用是根据一系列初步OD测量（数据未显示）确定的，这些测量检查了大肠杆菌对0至5毫摩尔范围内一系列过氧化氢浓度的生长响应。5毫摩尔浓度使细胞受到胁迫，以至于它们无法生长和产生新细胞，而低于5毫摩尔的浓度则允许一些生长。长期暴露于这种胁迫因子最终会导致细胞死亡，但短期暴露（少于2小时）不会诱导死亡，只要细胞在短期暴露后置于营养肉汤中（数据未显示）。
如图3A至D所示，活和死无害李斯特菌和大肠杆菌的细菌图在浮力质量上存在差异，但在浓度上没有差异。浮力质量差异对无害李斯特菌细胞更为明显，因为在死的无害李斯特菌细菌图（图3C）中，与活的无害李斯特菌（图3A）相比，很少有测量值大于50飞克。由于上一节所述的BHI培养基中存在颗粒，活和死无害李斯特菌的低于20飞克的测量值数量都非常大。肠出血性大肠杆菌O157:H7的活和死细胞测量值都大于50飞克，但活细胞的细胞测量值范围为50至200飞克（图3D），而死细胞的测量值为50至120飞克（图3B）。浓度曲线（图3E和F）显示，在2小时的实验过程中，活和死无害李斯特菌和大肠杆菌细胞的细胞浓度保持不变。浮力质量数据也以直方图格式呈现，以直接比较活细胞和死细胞之间的浮力质量，如图3G和H所示。
图3 受胁迫的活和死革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞的比较。（A和C）分别为含有5毫摩尔过氧化氢的BHI肉汤中活和死无害李斯特菌细胞的细菌图。（B和D）分别为含有5毫摩尔过氧化氢的最小培养基中活和死肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的细菌图。（E和F）分别为受胁迫活和死无害李斯特菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的浓度曲线。（G和H）从A至D面板中的细菌图获得的浮力质量数据直方图。
对于受胁迫的革兰氏阳性无害李斯特菌，活细胞的浮力质量大于死细胞。与用于非胁迫活和死细胞群的方法类似，使用双样本K-S检验比较受胁迫活和死浮力质量数据集的经验分布函数。在0.05显著性水平下，受胁迫活和死无害李斯特菌细胞群的浮力质量值代表相同分布的零假设被拒绝，P值为2×10^-3。相比之下，受胁迫的革兰氏阴性大肠杆菌的活和死浮力质量存在重叠。在0.05显著性水平下，受胁迫活和死大肠杆菌细胞群的浮力质量值代表相同分布的零假设未被拒绝，P值为0.25。总之，这些受胁迫的无害李斯特菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的浮力质量测量代表了活和死细菌细胞的一个物理特征。无害李斯特菌活和死细胞之间的浮力质量差异大于肠出血性大肠杆菌O157:H7，而两种细胞类型的细胞浓度随时间保持不变。浮力质量测量还可用于确定细胞的其他物理特征，特别是密度和总细胞质量，这将在以下各节中讨论。
革兰氏阴性肠出血性大肠杆菌O157:H7的密度和总细胞质量测量
Archimedes还可用于通过测量细胞群在两种不同密度流体中的浮力质量来确定平均细胞密度。这基于悬浮微通道谐振器的理论，其中浮力质量等于置换细胞的质量与流体质量之差，或MB = V(ρ - ρf)，其中MB是样品的浮力质量，V是细胞体积，ρ和ρf分别是细胞和流体的密度。这种线性关系可用于确定活和死肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的平均细胞密度和总细胞质量，如图4所示。
我们首先确定了活和死大肠杆菌细胞在两种流体中的平均浮力质量，一种流体密度大于细胞密度（图4B），另一种流体密度小于细胞密度（图4A）。当细胞密度小于流体密度时（漂浮细胞），浮力质量值为负；当细胞密度较大时（下沉细胞），浮力质量值为正。因此，平均浮力质量值对应于低和高密度值，并位于横坐标的两侧，如图4C所示。连接数据点的线的x截距对应于平均细胞密度（图4C），y截距对应于总细胞质量（图4D）。三次独立实验的肠出血性大肠杆菌O157:H7平均细胞密度，活细胞为1.1166±0.0007克/毫升，死细胞为1.1843±0.0051克/毫升。平均总细胞质量，活细胞为1,048±98飞克，死细胞为721±50飞克。有趣的是，活和死细胞在细胞密度和总细胞质量上都存在差异。死细胞的密度比活细胞大，总质量比活细胞小。
图4 肠出血性大肠杆菌O157:H7的密度和总细胞质量测量。（A）活和死肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞群在密度低于细胞的流体中的浮力质量直方图，由正浮力质量值表示。（B）活和死肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞群在密度高于细胞的流体中的浮力质量直方图，由负浮力质量表示。（C和D）活和死肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞群平均浮力质量的曲线图。虚线连接死细胞的正和负浮力质量点，实线连接活细胞的正和负浮力质量点。两条线的x截距（C）代表细胞密度值，y截距（D）代表总细胞质量值。
与其他关于大肠杆菌物理测量的报告相比，Godin等人报告使用相同的浮力质量测量方法，在PBS和Histodenz溶液中未暴露于任何胁迫因子的情况下，大肠杆菌（具有氨苄青霉素抗性的一次性菌株）的密度为1.160±0.001克/毫升。同样，Feijó Delgado等人报告固定的大肠杆菌（ATCC 23725）的总细胞质量值为727±15飞克。总的来说，这些发现说明了如何利用细胞群的浮力质量测量来确定细胞群的其他物理特征。这些大肠杆菌测量还突出了密度和总细胞质量等物理特征如何用于区分活和死革兰氏阴性细菌细胞。如前一节所示，当比较受胁迫活和死大肠杆菌细胞的浮力质量数据或随时间的细胞浓度时，存在很大重叠。受胁迫活和死大肠杆菌细胞的平均细胞密度和总细胞质量值具有更明显的分离，并且没有重叠。
革兰氏阳性无害李斯特菌的密度和总细胞质量测量
使用上一节描述的程序，还确定了受胁迫活和死无害李斯特菌细胞的平均细胞密度和总细胞质量。使用Archimedes确定了活和死无害李斯特菌细胞群在两种不同密度流体中的浮力质量值。图5A显示了活和死细胞群在密度低于细胞的流体（下沉细胞）中的正浮力质量值直方图。图5B显示了活和死细胞群在密度高于细胞的流体（漂浮细胞）中的浮力质量值直方图。这些平均浮力质量值与流体密度值一起绘制，如图5C和D所示。由这些点形成的线的x截距和y截距分别提供细胞的平均密度和总质量。两次实验的无害李斯特菌平均细胞密度，活细胞为1.1571克/毫升，死细胞为1.1615克/毫升。由于两次实验表明活和死细胞的密度相同，因此未进行第三次实验。两次实验的平均总细胞质量，活细胞为648飞克，死细胞为249飞克。据我们所知，没有其他报告记录过无害李斯特菌的密度或总细胞质量。与大肠杆菌的结果相反，受胁迫的活和死无害李斯特菌在浮力质量上存在差异，但在细胞密度上没有差异。对于两种细胞类型，活细胞的总细胞质量都大于死细胞。无害李斯特菌的密度和总细胞质量测量提供了革兰氏阳性活和死细菌细胞物理特征的信息。除了考虑同种类型受胁迫活和死细胞之间的差异外，这些测量还可用于比较不同细胞之间的物理特征。
图5 无害李斯特菌的密度和总细胞质量测量。（A）活和死无害李斯特菌细胞群在密度低于细胞的流体中的浮力质量直方图，由正浮力质量值表示。（B）活和死无害李斯特菌细胞群在密度高于细胞的流体中的浮力质量直方图，由负浮力质量表示。（C和D）活和死无害李斯特菌细胞群平均浮力质量的曲线图。虚线连接死细胞的正和负浮力质量点，实线连接活细胞的正和负浮力质量点。两条线的x截距（C）代表细胞密度值，y截距（D）代表总细胞质量值。
结论
本文展示了商用SMR Archimedes的应用，用于收集革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性无害李斯特菌细菌细胞的浮力质量测量值。我们证明了实时监测生长中细菌细胞群浮力质量的能力，并以细菌图格式呈现这些数据。我们考虑了浮力质量测量和浓度测量如何用于比较革兰氏阴性和革兰氏阳性细胞，以区分活和死细胞群。浮力质量测量数据还用于确定活和死细胞群的平均密度和总质量。这些附加特征可用于区分受胁迫的活细胞和死细胞。总的来说，所展示的工作有助于进一步开发现有技术，以观察低浓度细胞群并测量细胞的独特物理特征，这些特征可能有助于开发未来的诊断工具。我们设想，在识别和利用病原细胞的独特物理特征（如密度或总质量）以应对检测和确定食源性或水源性致病细菌活力的新型功能设备需求的概念之后，将取得相当大的进展。这是未来诊断应用的一个例子，而许多其他应用，如抗生素敏感性测试，也即将到来。
致谢
本研究是在作者Christina L. Lewis在美国陆军内蒂克士兵研究、发展与工程中心担任国家研究委员会研究助理奖期间进行的。我们非常感谢麻省理工学院生物工程系的Scott Manalis和内蒂克士兵研究、发展与工程中心食品保护团队的Patrick Marek的有益讨论和实验建议。我们还感谢Affinity Biosensors的Ken Babcock对Archimedes的协助。
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