2.3接种量对B.safensis生长及其产CA的影响
接种量对B.safensis生长及其产CA活性的影响如图3所示。接种量对细菌生长的影响无显著差异，均在36 h达到峰值，其中接种量为2%时，菌液OD₆₀₀值最高，为4.36。接种量为2%时，在12~60 h培养期内，CA的活性逐渐升高，60 h达到峰值。结果表明，在接种量为2%条件下更有利于B.safensis生长和获得高活性的CA。
图3接种量对B.safensis生长与CA活性的影响
a:生长曲线；b:酶活曲线
2.4培养温度对B.safensis生长及产CA的影响
如图4所示，随着温度升高，B.safensis生长加快，到达30℃最适温度后，其生长开始减慢，而在60℃时几乎不生长，这可能是高温对细胞内蛋白质和核酸等发生了不可逆的伤害。在35~45℃条件下，细菌在对数生长期的OD值最低，为2.31。与30℃相比，在35、40和45℃条件下，细菌数量分别在培养60、36、36 h后急剧下降，但其产CA的活性反而明显提高，其中温度为45℃时的酶活最高，60 h时的酶活约是30℃时的4.76倍。
图4培养温度对B.safensis生长与CA活性的影响
a:生长曲线；b:酶活曲线
为了验证B.safensis胞内是否产CA及温度对CA活性的影响，在接种量为2%、培养基初始pH值为7.0、摇床转速为150 r/min的条件下，设置培养温度为30、45℃，培养时间为84 h，定期检测其胞外及总CA的活性，结果见图5。结果表明，总CA的活性均高于胞内CA，表明B.safensis产胞内CA。温度为45℃、培养时间为60 h时，总CA的活性和胞内CA活性均达到最高。而且培养温度为45℃的总CA活性比30℃高5.7倍。
图5培养温度对B.safensis胞外和总CA活性的影响
2.5转速对B.safensis生长及其产CA的影响
在不同摇床转速条件下，B.safensis生长及其产CA的活性变化如图6所示。细菌的生长随着摇床转速的增加而加快。当转速为120 r/min时，细菌生长速度较慢，分泌积累的CA活性较低；当转速为180 r/min时，会产生较大的剪切作用，对酶的活性产生抑制；当转速为150 r/min时，CA活性最高，并在60 h达到最大值。
图6转速对B.safensis生长与CA活性的影响
a:生长曲线；b:酶活曲线
2.6金属离子对B.safensis产CA的影响
金属离子对B.safensis产CA活性的影响如图7所示。结果表明，Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺均能提高CA活性的表达。其中，0.010 mmol/L Mn²⁺的作用最大，比对照组提高了2.6倍；0.010 mmol/L Zn²⁺和0.005 mmol/L Mg²⁺次之，分别比对照组提高了1.59倍和1.69倍；0.005 mmol/L Ca²⁺也使CA的活性略有增加。而Cd²⁺对CA活性几乎没有影响，Co²⁺会抑制CA活性。
图7金属离子对B.safensis CA活性的影响
2.7最佳培养条件下B.safensis生长及其产CA特性
在最佳培养条件下，B.safensis生长及其产CA特性如图8所示。细菌几乎无生长迟滞期，快速进入对数期，24 h达到生长最大值，说明该菌株对环境具有很好的适应能力。24 h后细菌生长速度趋于平缓，进入生长稳定期，36 h后生长速度开始急剧下降，进入凋亡期。在12~60 h，CA活性逐渐升高，60 h达到峰值2.46 U/mL。60 h后CA活性逐渐降低，这可能是由于培养基营养物质的消耗，毒性产物（OH）的积累，其他蛋白酶的产生或抑制CA活性的胞外代谢物等原因造成的。
图8最佳培养条件下B.safensis生长曲线与CA活性曲线
a:生长曲线；b:酶活曲线
3讨论
掌握细菌的生长和产CA特性，对获得高活性酶液具有重要的意义。为了探明培养条件对B.safensis生长及其产CA的影响，通过单因素实验，确定了其产高酶活性CA的最佳培养条件。研究发现B.safensis产高酶活性CA的最佳培养条件与其最佳生长条件并不完全一致。该菌株在30℃条件下生长最快，而45℃时产CA的酶活性最高；在培养24 h时细菌生物量最大，但进入衰亡期（60 h）CA酶活性最大。微生物在适宜的生长环境下，生长迅速、代谢旺盛。Zheng等和Kaur等的研究表明B.mucilaginosus与B.megaterium的生长和产高酶活性CA的培养条件均一致，且生物量最大时酶活性最高。本研究中，通过总CA活性检测，证实B.safensis具有产胞内CA的能力。当温度升高或细菌进入衰亡期，菌体自溶导致了胞内CA外排，使总CA活性增高。因此，充分利用细菌胞内CA，获得高酶活性的酶液具有重要的实际意义。李为通过研磨破裂细菌细胞获得胞内CA。本研究采用细菌细胞裂解液裂解细菌，使细菌胞内CA释放，便于对胞内CA的进一步利用。
CA促进CO₂水合反应的核心机理是金属离子对CO₂的亲核攻击。因此，金属离子对CA活性影响显著。目前通常使用Zn²⁺作为辅助因子，激活CA活性。然而，在已发现的9种不同基因水平上的CA（α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ-、η-、θ-、ι-CA）中，虽然其结构相似度不高，但每种CA的活性中心都会结合一个对催化过程起着重要作用的金属离子。α-、β-、η-、θ-CA均以Zn²⁺作为辅助因子；γ-CA以Zn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺作为辅助因子；δ-CA以Zn²⁺、Co²⁺作为辅助因子；ζ-CA以Zn²⁺、Cd²⁺作为辅助因子；ι-CA以Mn²⁺作为辅助因子；而ε-CA的辅助因子至今未见报道。为了探明B.safensis产CA的辅助因子，研究了Zn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子对酶活性的影响。结果表明Mn²⁺对B.safensis CA活性的激活作用最显著。最近，Jensen等从Thalassiosira pseudonana中鉴定了一种以Mn²⁺作为CA辅助因子的新型ι-CA。推测获得的B.safensis菌株也可能产ι-CA。
相关新闻推荐
1、牛支原体分离株YJ-22的分离鉴定、生长特性、致病性及免疫原性研究（三）
2、尼古丁、烟草浸出液、烟雾提取物对口腔常见微生物的影响（一）