结果和讨论
用光密度和浮力质量测量监测肠出血性大肠杆菌O157:H7的生长。
我们使用Archimedes和Bioscreen监测了肠出血性大肠杆菌O157:H7在最小培养基（配方详见材料和方法）中暴露于不同浓度氯化钠期间的生长。如图1A至D所示，Archimedes提供了随时间生长的细胞群中单个细胞的浮力质量测量值。这些数据以随时间从细胞群收集的单个细胞浮力质量测量值的格式表示，即细菌图。在没有氯化钠胁迫因子的情况下（图1A），细胞的浮力质量逐渐增加，然后在细胞分裂和数量增加时下降，这通过图上点数的增加显示出来。向最小培养基中添加低浓度（1%和2%[重量/体积]，或分别为171和342毫摩尔）的氯化钠会延迟细胞生长和细胞数量的增加，如图1B和C所示。在最小培养基中含有3%（重量/体积）或513毫摩尔氯化钠时，肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞不再增加大小或数量，而是保持在150飞克的浮力质量不变，如图1D所示。从Archimedes获得的单个细胞的浮力质量数据也可用于生成细胞生长的浓度曲线，如图1E所示。为此，如材料和方法中所述，对5分钟窗口中的细胞进行量化，并乘以总实验时间以及总样品浓度。浓度曲线显示，暴露于氯化钠的细胞以低于未暴露于氯化钠的细胞的速率增加浓度。暴露于3%（重量/体积）或513毫摩尔氯化钠的细胞浓度保持恒定。
为了比较用Archimedes观察到的细胞生长与用Bioscreen获得的光密度（OD）测量结果，用于生成Archimedes数据（图1A至E）的细胞储备液样品使用Bioscreen并行分析，如图1F所示。Archimedes和Bioscreen的初始细胞浓度均为100万个细胞/毫升，这高于Archimedes的检测限，但低于Bioscreen的检测限。McKellar和Knight报告，Bioscreen光密度测量的检测限为每孔3.5×10^6 CFU或每毫升1×10^7 CFU。我们通过Archimedes工作观察到的最低细胞浓度为10^5/毫升。
OD测量（图1F）显示了与Archimedes相同的细胞生长趋势，即OD值随氯化钠浓度增加而以较低的速率增加。然而，Archimedes能够在比Bioscreen更低的浓度下检测到细胞生长的变化。图1E显示，未暴露于任何胁迫的细胞在观察仅50分钟后呈指数增长，而在Bioscreen上直到观察200分钟后才检测到指数增长。此外，由于使用Bioscreen进行的细胞生长测量以光密度的任意单位表示，因此要在OD生长测量的同时获得浓度数据，需要在所需时间点接种细胞并等待至少1天以手动计数细胞菌落来计算浓度。虽然Bioscreen提供了在一块板中监测100个单独样品长达数天的优势，但Archimedes以低于Bioscreen所需的浓度实时提供一个样品的浮力质量和浓度数据。需要更严格的方法和实验设计来确定在初始细胞浓度低于两种仪器检测限的情况下，用Archimedes与Bioscreen观察生长所需的最短时间。
图1 监测细菌生长。（A至D）肠出血性大肠杆菌O157:H7在最小培养基中暴露于0、1、2和3%（重量/体积）氯化钠浓度期间的细菌图。（E和F）肠出血性大肠杆菌O157:H7在最小培养基中生长时，氯化钠浓度增加的浓度曲线（E）和光密度测量（F）。
鉴于100万个细胞/毫升的初始浓度，我们已经证明肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的浮力质量在细胞分裂前增加。此外，如分别从Archimedes和Bioscreen获得的浓度曲线和OD测量所示，肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞在外源氯化钠存在下以较低的速率生长。当比较随时间获得的浓度曲线和OD测量时，用Archimedes在比Bioscreen更低的细胞浓度下观察到细胞生长。总的来说，这些结果证明了使用Archimedes以细菌图格式随时间观察生长中细菌细胞群浮力质量的能力。这些结果还显示了与Bioscreen获得的光密度测量相比，SMR仪器的灵敏度。
利用Archimedes比较活和死革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞群的特征
为了评估和比较活和死革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞的特征，我们使用Archimedes获得了活和死无害李斯特菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的细菌图和浓度曲线。革兰氏阳性无害李斯特菌细胞在脑心浸液（BHI）肉汤中监测2小时，而肠出血性大肠杆菌O157:H7在最小培养基中监测相同时间。由于即使在BHI等营养肉汤中，无害李斯特菌的生长也比大肠杆菌慢得多，因此在用Archimedes分析前，无害李斯特菌样品在37°C下孵育90分钟。如图2A至D的细菌图所示，对于无害李斯特菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7，活细胞的浓度和浮力质量与死细胞相比都有所增加。
活细胞的浮力质量也大于死细胞：活的无害李斯特菌的平均浮力质量为104.4飞克，而死的无害李斯特菌为15.5飞克。同样，活的大肠杆菌细胞的平均浮力质量为174.5飞克，而死的大肠杆菌为70.8飞克。活的无害李斯特菌的细菌图（图2A）显示了两个区域的测量值：一个区域由大于40飞克的浮力质量值组成，另一个由低于40飞克的浮力质量值组成。虽然在任何生长的细菌群中总有死细胞，但在低于40飞克的浮力质量值下捕获的大多数测量值代表BHI培养基中的颗粒。即使培养基用0.2微米过滤器过滤灭菌，这些颗粒在监测不含细胞的BHI肉汤时也会被捕获（数据未显示）。因此，死的无害李斯特菌细胞的细菌图显示了培养基颗粒和死细胞，因为它们的浮力质量值重叠。
图2 活和死革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞群的比较。（A和C）分别为BHI肉汤中活和死无害李斯特菌细胞的细菌图。（B和D）分别为最小培养基中活和死肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的细菌图。（E和F）分别为BHI和最小培养基中活和死无害李斯特菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的浓度曲线。（G和H）从A至D面板中的细菌图获得的浮力质量数据直方图。
还应注意的是，死细胞群中的细胞死亡是使用异丙醇诱导的（程序详见材料和方法），已知异丙醇会破坏细胞膜。在本研究中观察到的死细胞群浮力质量的下降，部分是由于细胞膜的破坏。可以考虑使用其他杀灭剂来诱导细胞死亡，如叠氮化物或苯扎氯铵，尽管也需要检查用这些药剂诱导细胞死亡的机制和物理结果。异丙醇是文献中报告的诱导细菌细胞死亡的标准方法，也用于LIVE/DEAD Baclight细菌活力和细胞计数试剂盒，这是Life Technologies销售的用于流式细胞术分析的Molecular Probes产品。然而，自然死亡的细菌细胞与通过酒精处理杀死的细胞之间的物理差异尚未在本工作中进行深入研究，应承认为本研究中代表的死细胞群的潜在偏差。
浓度曲线（图2E和F）显示，与死细胞的恒定浓度曲线相比，活细胞和生长细胞的浓度增加。为了更好地将活细胞和生长细胞的浮力质量与死细胞进行比较，将细菌图中的浮力质量数据编译成直方图格式，如图2G和H所示。对于无害李斯特菌，图2G显示活细胞的浮力质量大于死细胞或培养基碎片，并且与之分离。同样，图2H显示活的大肠杆菌细胞的浮力质量大于死细胞，尽管在100至140飞克的浮力质量范围内，活和死的大肠杆菌细胞存在相当大的重叠。使用双样本Kolmogorov-Smirnov（K-S）检验比较无害李斯特菌和大肠杆菌细胞活和死浮力质量数据集的经验分布函数。
在0.05显著性水平下，活和死细胞群的浮力质量值代表相同分布的零假设被拒绝，大肠杆菌的P值为8×10^-6，无害李斯特菌为8×10^-7。总之，这些结果表明，对于革兰氏阳性无害李斯特菌和革兰氏阴性肠出血性大肠杆菌O157:H7，活细胞的浮力质量都大于死细胞。在实时提供细胞群的浮力质量和浓度值的同时，我们考虑了如何利用Archimedes的测量来识别不同细胞群（如活细胞和死细胞）的独特特征。
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