材料和方法
细菌规格和实验条件
肠出血性大肠杆菌O157:H7（ATCC 43888）在Luria-Bertani（LB）肉汤中过夜培养至稳定期（10^8至10^9个细胞/毫升）。大肠杆菌实验使用Burnett等人描述的专为肠出血性大肠杆菌O157:H7设计的最小盐培养基（MSM）进行。无害李斯特菌ATCC 33090在脑心浸液（BHI）肉汤中过夜培养至稳定期（10^8至10^9个细胞/毫升）。实验也在BHI肉汤中进行。对于所有活细菌实验，细胞通过离心（相对离心力[RCF]为2,500，10分钟）沉淀，并在相同体积的最小培养基中重悬，以保持稳定期细胞浓度。大肠杆菌使用MSM，无害李斯特菌使用Tsai和Hodgson为单核细胞增生李斯特菌描述的合成最小培养基。重悬的细胞在实验前储存在4°C，以尽量减少生长或从稳定期的变化。
对于所有死细菌实验，健康活细胞通过离心沉淀，并在含有70%（体积比）异丙醇的最小培养基中重悬。细胞在含酒精的培养基中暴露30分钟以确保细胞死亡。然后将死细胞离心并在最小培养基中重悬，储存在4°C（与上述活细胞的离心条件和重悬体积相同）。为了使用悬浮微通道谐振器Archimedes或Bioscreen获取细胞生长或响应数据，制备了10毫升所需条件的溶液（生长培养基、最小培养基，含或不含氯化钠或过氧化氢胁迫因子）。将重悬的活或死大肠杆菌或无害李斯特菌细胞加入测试溶液中，最终浓度为10^5至10^6个细胞/毫升（10微升细胞储备液）。由于即使在营养肉汤与最小培养基中相比，无害李斯特菌的生长也比大肠杆菌慢得多，因此无害李斯特菌细胞在胁迫因子暴露或SMR分析前在37°C下孵育90分钟。氯化钠按收到的原样从Sigma-Aldrich购买，用于制备特定浓度的胁迫因子溶液。CareOne过氧化氢（3%溶液）在本地非处方药柜台购买，按收到的原样使用。
细胞测量和分析仪器
浮力质量测量使用Archimedes系统及其指定操作软件Particle Lab（来自Affinity Biosensors, LLC）进行。本工作使用的悬臂传感器是微型版本，尺寸为200微米×8微米×8微米（长度×高度×宽度）。传感器使用Duke Standards的1.034微米聚苯乙烯微球进行校准。所有实验均在37°C下进行；样品瓶悬浮在设定为此温度的外部水浴中。使用仪器的自动补充功能，每5分钟为细胞群样品补充15秒。为此，包含待研究细胞群的样品瓶中的样品通过仪器流体系统以压力驱动流的方式补充15秒，使样品瓶中存在的细胞样品补充到仪器的悬臂传感器位置。在整个实验过程中，每5分钟将新鲜的细胞群样品加载到悬臂传感器中。实验数据，包括细胞数量、浮力质量、时间以及额外的汇总测量值，如总测量时间、测量体积和总浓度，都从Particle Lab导出为.csv文件。然后将数据导入MATLAB，用于准备本报告中显示的所有细菌图、直方图和浓度曲线。细胞浓度曲线使用以下公式生成：
细胞数/毫升 = (总细胞浓度 × 总测量时间) / 时间窗口
= 窗口中的总细胞数 / 获取的总细胞数
细胞浓度、测量时间和获取细胞的总值是每个Archimedes实验的标准汇总值的一部分。时间窗口值设定为5分钟，窗口中的细胞值由定制的MATLAB程序生成，该程序用于确定所分析每个数据集的50分钟窗口内测量的细胞总数。
OD测量使用来自芬兰赫尔辛基的Bioscreen C全自动生长曲线分析仪获得。样品分配到100孔板中的10个孔（一行）中，每孔总体积为300微升。板边缘的行填充磷酸盐缓冲盐水（PBS），不用于分析，以减轻边缘效应。位于板边缘的样品孔也因边缘效应而在分析中被排除。因此，使用来自8个孔的平均8个OD测量值进行数据收集。EZ Experiment软件用于操作Bioscreen并收集和导出数据。OD测量每15分钟获取一次，持续24小时。样品板保持在37°C的温度，板在每次测量前摇动10秒。时间和OD测量数据导出为.csv文件，导入MATLAB，并用于生成图1所示的生长曲线。
总细胞质量和密度测量
如结果和讨论中图4简要提到的，当在不同密度的流体中测量时，可以从细胞群的平均浮力质量测量值确定总细胞质量和密度。方程MB = V(ρ - ρf)可以线性化为：MB = (-V)ρf + M，其中MB是细胞浮力质量，V是细胞体积，M是总细胞质量，ρf是流体密度。这条线的重要特征是x和y截距，分别提供平均细胞群密度和总质量。
对于本报告中呈现的数据，生成了Archimedes频率值与已知溶液密度的标准曲线。已知密度的溶液由水中的氯化钠组成。使用该标准曲线，确定了用于测量大肠杆菌和无害李斯特菌细胞浮力质量的四种溶液的密度值。密度测试溶液由20%或70%（体积比）OptiPrep密度梯度培养基在培养基（MSM或BHI，取决于细胞类型）中加入5毫摩尔过氧化氢胁迫因子组成。OptiPrep密度梯度培养基从Sigma-Aldrich购买，使用前用0.2微米过滤器过滤灭菌。OptiPrep由60%（重量/体积）碘克沙醇组成。
根据制造商Axis-Shield的信息表，OptiPrep的溶液密度在20°C时为1.320±0.001克/毫升，渗透压为170±15毫渗量。制造商声明碘克沙醇是非离子的、无毒的，对细胞代谢惰性，且碘克沙醇溶液具有低粘度和低渗透压。选择OptiPrep的浓度是为了提供密度大于或小于细胞密度的溶液。将OptiPrep加入较低密度的溶液中，以尽量减少溶液渗透压的差异。使用Wescor（犹他州洛根）渗透压计测量每种测试溶液的渗透压。对于大肠杆菌，低和高OptiPrep浓度与MSM的值分别为154和284毫摩尔/千克。对于无害李斯特菌，低和高OptiPrep浓度与BHI的值分别为297和438毫摩尔/千克。如前所述，由于无害李斯特菌生长缓慢，细胞在暴露于OptiPrep和胁迫因子前在BHI培养基中单独孵育90分钟。每种密度条件测量了约5,000个细胞。细胞群的平均浮力质量值用于形成浮力质量与流体密度的关系图。
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