结果与讨论
新型β-糖苷酶LamN的计算机辅助鉴定与异源表达
对首批完成基因组测序的两株坎氏弧菌菌株BAA-1116和HY01的测试显示，只有菌株HY01——一株来自泰国合艾的发光黑虎虾分离株——能够利用海带多糖作为唯一碳源进行复制。使用标准蛋白质BLAST（blastp）和显著性相似性截断e值1e-5，通过计算机辅助减法蛋白质组学策略比较两株菌株，鉴定出340个预测为HY01菌株特有的蛋白质。从这个子集中，一个先前未表征的蛋白质（GenBank登录号EDL69935.1）被预测编码一种924氨基酸（AA）的β-糖苷酶（EC 3.2.1.21），因此被作为进一步研究的目标。我们暂时将ORF EDL69935.1命名为LamN。基于HY01lamN基因序列设计PCR引物，用于筛选另外10株坎氏弧菌菌株和16株哈维氏弧菌菌株。虽然12株（58%）坎氏弧菌菌株（HY01、602L、CAIM 115、501J、CAIM 198、42A、9078-83）似乎携带lamN基因，但在任何测试的哈维氏弧菌菌株中均未检测到。随后从这26个分离株中生成的草图基因组序列证实了这一发现。有趣的是，所有七个含lamN基因的菌株也都携带完整的细菌生物发光操纵子。
推定的LamN β-糖苷酶的系统发育分析揭示了坎氏弧菌内的高氨基酸保守性（>98% AA同一性），并鉴定了来自弧菌属其他成员和密切相关属的同源物（弧菌属、肠弧菌属、嗜冷菌属内>64% AA同一性）（图1a）。重要的是，所有鉴定的同源物都来自已完成或草图基因组测序工作，只有一个——白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）β-糖苷酶Ra1595——已被表征。该基因的系统发育分布表明它可能是通过水平转移获得的，因为所得系统发育没有重现弧菌属内公认的相对进化顺序，并且弧菌属是唯一的革兰氏阴性细菌（除挪威肠弧菌、英格拉姆氏嗜冷菌、产酸克雷伯菌和产琥珀酸密螺旋体外）携带该基因。有趣的是，携带LamN同源物的革兰氏阳性细菌中有93%属于厚壁菌门——一个以其代谢藻类碳水化合物能力而闻名的门。
使用CAZymes分析工具包对LamN的序列特征进行进一步分析，鉴定出三个结构域：一个N端结构域、一个C端结构域和一个纤连蛋白III型样（Fn3）结构域。有趣的是，与其他β-葡聚糖酶相比，坎氏弧菌LamN的结构域组织是颠倒的，这可能解释了在成对比对中与其他糖苷水解酶（GH）缺乏序列同一性的原因。N端结构域与带有Fn3结构域的家族3糖苷水解酶（GH3）的C端结构域共享序列同一性[与那不勒斯热袍菌（Thermotoga neapolitana）Bgl3B（TnBgl3B）PDB 2X41的序列同一性为36%，与PDB 4I8D的同一性为27%]，而C端结构域与PDB 2X41的N端结构域共享40%的同一性，这表明两个结构域可能在坎氏弧菌LamN中发生了交换。类似地，最近在GH3家族白色瘤胃球菌β-糖苷酶Ra1595中也描述了颠倒的结构域，LamN与其共享47%的AA同一性（图1a）。与LamN一样，Ra1595也有一个预测的Fn3结构域。
GH3的活性位点残基已被鉴定。在TnBgl3B（PDB 2X41）中，Asp-242在反应中充当亲核试剂，而Glu-458充当一般酸/碱。当LamN的N端结构域与其他GH3的C端结构域对齐，反之亦然时，可以在坎氏弧菌LamN中找到与这些活性位点残基对齐的残基，这可能表明只由多肽形成一个活性位点。LamN的C端结构域还与大麦的β-D-葡聚糖外水解酶（PDB 1EX1）共享序列同源性。PDB 1EX1缺乏Fn3结构域，但与GH3 TnBgl3B（PDB 2X41）具有相同的整体折叠。其他GH家族也携带Fn3结构域，如GH家族9、10、31、43、59和84。有趣的是，在细菌中，Fn3结构域已在细胞外GH中发现，虽然其作用仍不清楚，但有人提出它们可以破坏纤维素表面以促进其水解。
对来自基因组测序工作的lamN基因座（可找到组装的连续序列信息）的检查揭示了弧菌属间保守的基因共线性（图1b）。虽然缺乏如降解海带多糖的拟杆菌中所描述的多糖利用位点的组织和常见成分，但发现lamN基因侧翼有一个保守的ORF和四个推定注释为malR（麦芽糖操纵子转录阻遏物）、lamB（麦芽糖孔蛋白）、araC（转录调节因子，AraC家族）和matE（钠驱动多药外排泵）的基因。
LamB麦芽糖孔蛋白的共定位很有趣，因为细菌麦芽糖孔蛋白是外膜蛋白，促进糊精（α-葡聚糖）如麦芽糖和麦芽糊精易位到周质空间。由于这种推定的LamB麦芽糖孔蛋白转运体的底物特异性尚未通过实验确定，并且鉴于其与LamN的接近性，我们不能排除这种预测的麦芽糖孔蛋白的底物特异性可能包括海带多糖的可能性。
在大肠杆菌中建立了异源过表达系统，以验证坎氏弧菌HY01 LamN的序列预测功能。在含有lamN质粒或空质粒对照的两种大肠杆菌构建体在LB中在诱导剂IPTG存在或不存在的情况下生长。对37°C表达3小时的粗细胞裂解物进行SDS-PAGE分析表明，约101 kDa的表达产物可在IPTG诱导培养物的细胞沉淀中找到（图1c）。切下约101 kDa的SDS-PAGE条带，处理并进行LC-MS/MS分析。分析鉴定了来自LamN的19个独特肽段，离子分数截断值为47[表明同一性或广泛同源性（P < 0.05）]，覆盖蛋白质的36%。使用类似的分析确认了用于动力学研究的可溶性纯化LamN蛋白的同一性。
两种大肠杆菌构建体也在M9培养基加海带多糖中在IPTG存在或不存在的情况下生长，同时测量每株菌株的细胞生长并绘制成时间函数。只有携带含lamN质粒的IPTG诱导细胞才能在这些条件下进行二分裂，从而确认LamN是一种具有海带多糖酶活性的功能性β-糖苷酶（图1d）。考虑到生长的延迟和异源表达蛋白的周质定位，LamN很可能在细菌周质中积累，直到细胞裂解将功能性酶释放到含海带多糖的细胞外培养基中，使多糖水解成细胞可用于生长和复制的形式。
图1. 坎氏弧菌HY01 β-糖苷酶（LamN，ORF EDL69935.1）的系统发育分析、基因座和异源表达。(a) 邻接法树显示坎氏弧菌LamN相对于所有可用序列（显示>47% AA同一性）的系统发育位置。816个AA的进化距离分析使用泊松校正方法和MEGA5程序计算。来自1000次模拟的>50%自举值显示在每个分支点的左侧。粗体指定的物种被作为进一步表征的目标。括号中的蓝色数字表示与坎氏弧菌HY01 LamN的AA百分比同一性。星号表示其基因组序列用于比较基因座分析（如下）的菌株。比例尺代表每个位点的AA替换数。
(b) 来自坎氏弧菌HY01和其他具有可用草图基因组序列的物种的含lamN基因座。ORF（开放阅读框）、malR（麦芽糖操纵子转录阻遏物）、lamB（麦芽糖孔蛋白）、araC（转录调节因子，AraC家族）、lamN（海带多糖酶）、matE（钠驱动多药外排泵）、bgl（β-葡聚糖酶）、bax（bax结构域蛋白）、dha（脱氢酶）、dcc（推定硫醇-二硫键氧化还原酶）、sdr（可能的氧化还原酶）、uvrD（解旋酶）。
(c) 未诱导和IPTG诱导的大肠杆菌培养物及纯化LamN的SDS-PAGE电泳图。M-MW标记，1—未诱导空质粒对照，2—0.5 mM IPTG诱导空质粒对照，3—未诱导含lamN质粒，4—0.5 mM IPTG诱导含lamN质粒，5—纯化LamN。箭头表示诱导的约101 kDa蛋白质。(d) 含lamN和空质粒构建体的大肠杆菌在M9培养基中使用海带多糖作为唯一碳源的生长。测量每株菌株的细胞生长（OD600）并绘制成时间函数。灰色方块 = 空质粒对照，黑色方块 = 空质粒对照 + 0.5 mM IPTG，灰色圆圈 = 含lamN质粒，黑色圆圈 = 含lamN质粒 + 0.5 mM IPTG。
相关新闻推荐
1、增温和二氧化碳富集对土壤细菌的生长策略、系统发育模式的影响（一）
2、环丙烷脂肪酸修饰在鼠伤寒沙门氏菌应激抵抗和毒力中的关键作用（一）
3、Bioscreen C实验发现：尿苷酸化决定mRNA降解方向的新机制