LC-MS/MS分析
将来自M9最小培养基加葡萄糖、甘油或海带多糖中期培养物（15 mL）的细菌细胞沉淀溶解于500 μL含2% SDS的100 mM碳酸氢铵（ABC）中，并通过超声破碎裂解。溶液在4°C下离心澄清，所得上清液与十二烷基硫酸锂上样缓冲液（Life Technologies）混合，煮沸10分钟，上样至4-12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶（Life Technologies）。样品在恒定电压（106 V）下使用MOPS [3-(N-吗啉代)丙磺酸]运行缓冲液（Life Technologies）分离2小时。凝胶用水洗涤并用Bio-Safe考马斯亮蓝染色（Bio-Rad）。从每个样品泳道中切下约100 kDa的蛋白质条带簇，用脱色缓冲液（50%乙腈中的500 mM ABC）洗涤，切成小块并用100%乙腈脱水。干燥的凝胶块在测序级改良胰蛋白酶（Promega）溶液中复水，并消化过夜。消化的肽段用2%甲酸在50%乙腈和100%乙腈洗涤液中收集，加超声处理，并在真空浓缩仪中干燥。然后将肽段重悬于20 μL含0.1%甲酸的5%乙腈中，使用Tempo nano-LC耦合至QStar Elite质谱仪（AB Sciex）进行LC-MS/MS分析。样品首先通过非靶向数据依赖方法分析，其中三个最强离子通过MS/MS分析。获得的MS/MS谱图通过Mascot（2.4.1版）针对三个数据库（SwissProt 201211538585条序列，191240774个残基；内部LamN同源物数据库，4条序列，3517个残基；污染物数据库，247条序列，128130个残基）进行搜索。肽段和片段质量容差设置为0.8 Da，最大酶漏切位点为3。选择甲硫氨酸氧化和谷氨酰胺及天冬酰胺脱酰胺作为可变修饰。如果使用数据依赖方法没有肽段被分配给LamN，则将来自预测胰蛋白酶序列的四个前体离子分子量添加到包含列表中以进行靶向分析。
LC-MS/MS还用于测定坎氏弧菌HY01的细胞外蛋白质组。简言之，将来自M9最小培养基加海带多糖中期培养物的25 mL无细胞上清液通过依次使用10 kDa MWCO和30 kDa MWCO过滤器浓缩至50 μL。该浓缩蛋白样品与十二烷基硫酸锂上样缓冲液混合，煮沸10分钟，上样至4-12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶，并按上述方法处理。
坎氏弧菌lamN的克隆与异源表达
使用Platinum® Pfx DNA聚合酶（Invitrogen）、引物Vglu Ms F（5′-AGGCCTGGCC ATGAACAATAAACAAATTAGCC-3′，含MscI位点）和Vglu Xh R（5′-CTTAACTCGAGCTCTCTGATAATCGTGATTTG-3′，含XhoI位点）从坎氏弧菌HY01基因组DNA制备物中PCR扩增lamN基因，扩增条件如下：94°C 30秒、55°C 90秒、68°C 3分钟，共35个循环。约3 Kb的扩增子经凝胶纯化（Qiagen），用MscI和XhoI（New England Biolabs）消化，克隆到pET-22b表达质粒（Novagen）中，并转化到TOP10化学感受态细胞（Life Technologies）中。然后将经确认的含lamN质粒和空质粒对照转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，使用One Shot®转化试剂盒（Life Technologies）。含质粒的细胞在补充有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基（LB/Amp）中37°C、250 rpm培养至OD600nm = 0.5。通过添加0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达，并在37°C、250 rpm下孵育3小时。然后收集细胞，用M9培养基洗涤，重悬于M9最小培养基+100 μg/mL氨苄青霉素和1%海带多糖作为唯一碳源中，并使用Bioscreen C分析仪监测细菌生长。为了检查蛋白质表达和纯度，将4×10⁷个细胞和25 μg纯化蛋白（如下所述）上样至10% BisTris NuPAGE预制胶（Life Technologies）上，在125 V下使用1× MES运行缓冲液（Life Technologies）电泳90分钟，并用Bio-Safe考马斯亮蓝染色可视化。
对于所有酶活性测定用LamN的纯化，将含lamN pET-22b质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的1.5 L LB/Amp培养物培养至OD600nm约1.0，并使用0.2 mM IPTG在17°C下诱导周质表达过夜。细胞用30 mM Tris（pH 8.5）、0.5 mM EDTA和20%蔗糖在4°C下洗涤10分钟。细胞通过离心收集，重悬于5 mM Tris（pH 8.5）、0.5 mM EDTA中，并在4°C下与25 U DNase搅拌1小时。离心（30分钟，20500 g）后，将裂解物上样至用50 mM Tris（pH 7.6）和500 mM NaCl平衡的镍电荷螯合Sepharose柱（G.E. Healthcare）上，用含60 mM咪唑的相同缓冲液洗涤，并用含300 mM咪唑的相同缓冲液等度洗脱。合并含酶的组分，并在4°C下在50 mM Tris（pH 7.6）、250 mM NaCl中透析过夜，然后浓缩并储存在25 mM Tris（pH 7.6）、125 mM NaCl、50%甘油中于-20°C。酶活性测定前使用PD-10柱（G.E. Healthcare）去除甘油。
酶活性测定
按照制造商说明使用葡萄糖比色/荧光测定试剂盒（BioVision Inc.）检测游离葡萄糖。比色探针在570 nm处检测，并使用标准曲线（nmol葡萄糖对A570nm）将吸光度单位转换为产物的nmol数。一个单位定义为每分钟释放1 μmol葡萄糖，比活性定义为单位每毫克酶。所有测定均在室温（23±3°C）下于1× PBS（pH 7.4）中进行。LamN活性还在pH 5.5的80 mM乙酸钠缓冲液中测量。将酶和各种底物[海带二糖、纤维二糖、龙胆二糖（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）；乳糖、纤维素、海带多糖天青（CarboMer Inc.）；地衣多糖（Megazyme International Ireland）；来自掌状海带（Laminaria digitata）的海带多糖（Sigma-Aldrich Inc.）]混合并孵育10分钟，然后煮沸3分钟以停止反应。反应物在10000 rpm下离心3分钟，取10 μL等分试样，与测定试剂1:1混合，并测量（A570nm）。对于海带多糖天青，将100 μL的1 mg/mL溶液（溶于100 mM乙酸钠，pH 5.5）与10 μL的3.8 μM LamN或1× PBS（pH 7.4）在室温下孵育22分钟。向每个样品中加入600 μL 95%乙醇以沉淀未切割的底物。溶液用0.22 μm旋转过滤器（Millipore Inc.）过滤，并在595 nm处测量释放的染料。
圆二色谱
对于圆二色实验，使用PD-10柱（G.E. Healthcare）将酶缓冲液交换至1× PBS pH 7.4。使用配备Peltier温度控制单元的Jasco 810圆二色光谱仪在222 nm处监测热变性（每分钟2°C），从20°C到100°C。蛋白质浓度为0.25 mg/mL，使用1 mm比色皿进行分析，扫描范围在195至250 nm之间。