4. 单细胞建模的变异性
单细胞行为的变异性主要来自以下来源：（1）生物学变异性（生理状态）和（2）与加工、处理或食品条件相关的环境因素（图7）。
图7. 影响单细胞行为变异性的因素总结图。主要来源包括生物学变异性（内在和外在噪声）和环境因素（食品特性、加工条件、储存条件等）。
4.1. 生物学变异性（生理状态）
有研究者证明，开发预测模型不仅需要一个简单的经验方程，还需要了解方程背后的生理基础。单个细胞间的生物学变异性是由随机事件控制的，也称为噪声。通常，噪声可分为内在和外在。内在噪声主要与细胞内自然发生的随机基因表达有关。例如，有研究者实时监测了活的单个大肠杆菌细胞中β-半乳糖苷酶的表达。外在噪声来自调控物质的变化，例如转录因子、聚合酶、核糖体和细胞周期阶段。
4.2. 环境因素
环境因素，例如食品特性（例如，pH值、水分活度、结构等）、储存和运输条件（例如，温度、气体氛围等）、加工处理（例如，干燥、加热、冷冻、辐照、防腐剂等）以及细胞间相互作用，都会影响单细胞行为的变异性。随着环境胁迫强度的增加，变异性变得更大。有研究者发现，随着温度升高，克罗诺杆菌属细胞的延滞期变得更加多变，并且在直方图上向右移动。除了单一胁迫因素外，不同环境因素的组合可能对个体细胞变异性产生更显著的影响。有研究者报告，与温度、pH值和a_w的单独效应相比，当三种胁迫因素结合时，单核细胞增生李斯特菌的延滞期分布出现了额外的右移。此外，环境因素转变的幅度与单细胞的变异性有关。有研究者观察到，预孵育条件和生长条件之间较大的温度变化导致了更大的变异性和细胞延滞期分布。因此，在对微生物单细胞建模时，应考虑外部刺激。
5. 单细胞模型
传统上，预测模型可以根据其参数分为三类：一级模型，描述恒定环境下微生物数量随时间的变化；二级模型，包括环境因素（pH、温度等）对一级模型参数的影响；三级模型，依赖于结合一级和二级模型的软件。已经建立了大量具有一组稳定参数（例如，N₀, μ_max, λ）的确定性模型来模拟食品中微生物的生长。然而，这些经典的确定性模型由于缺乏对个体细胞生理状态的洞察、高变异性和随机性，无法真实反映低细胞数量或单细胞的情况（在第5.1节中提到）。同时，考虑到个体细胞行为的随机模型已被提出，以提高单细胞建模的准确性。单细胞随机模型的使用强调了随机参数的分布。
在过去的二十年里，生长动力学，特别是单个延滞期、生长潜力以及食品特性的变异性，已被研究以提高单细胞建模的准确性。
5.1. 生长动力学建模
5.1.1. 延滞期分布
大量研究表明，较小的初始接种量可能导致群体延滞期更长，显示了单个延滞期的变异性。因此，单细胞延滞期应该用一个分布而不是一个常数值来表征。早期有许多研究关注单个延滞期的分布。
有研究者首次建立了一个三线性模型来预测单细胞的生长。在该模型中，细胞的生长曲线分为三个部分，由以下公式描述：
其中 N 是细胞总数；t_mi 被称为世代时间，定义为细胞 i 积累足够复制物质所需的时间，它取决于细胞 i 产生关键复制物质的速率。适应时间（t_ai）的特征是细胞 i 对新环境做出充分调整所需的时间。因此，单个延滞期（λ）分布取决于世代时间（t_m）和适应时间（t_a）的变化。然而，研究者假设与 t_m 和 t_a 相关的方差很小且可以忽略，导致生长曲线上的延滞期和指数期之间存在突变。因此，三部分线性模型失去了其随机意义。
后来由另一位研究者建立的随机模型已被广泛用于单细胞建模。在该模型中，如果初始培养物含有 N₀ 个单个细胞，则细胞数（N_t）和时间 t 的方程可以用以下方程描述，其中 μ 是比生长速率，λ_i (i=1,2,...,N) 指细胞 i 的延滞期。
其中 v 是平均单个延滞期（λ）的倒数。
此外，单个延滞期 λ_i (i=1,2,...,N) 可以用期望值为 λ = f/m 的伽马分布来拟合。参数 f 和 m 是伽马分布的形状和尺度参数。有研究者证明，假设单个延滞期服从指数分布、伽马分布或对数正态分布，都能为该模型提供良好的拟合。此外，有研究者证明，极端值分布最适合拟合植物乳杆菌的单个延滞期分布。另有研究者用六种常见分布拟合了大肠杆菌 O157:H7 的单个延滞期，根据Anderson-Darling统计量，拟合优度排序为：Pearson V > Pearson VI > 极值 > 对数正态 > 对数正态2 > 逆高斯。类似地，有研究者发现，与对数正态、移位伽马和移位威布尔分布相比，极值II型偏态分布（设定形状参数为5）最适合描述单核细胞增生李斯特菌的单个延滞期分布。他们还注意到，对数正态分布具有最佳值，因为其参数变异性较小且具有生物学意义。随后，有研究者发现，更高的胁迫水平会导致单核细胞增生李斯特菌单个延滞期分布的更大变异。他们还指出，在严苛环境下威布尔分布更合适，而在温和条件下伽马分布拟合效果更好。有研究者报告，预孵育和生长条件之间的差异越大，单核细胞增生李斯特菌单个延滞期的变异性就越大。这些研究为环境胁迫因素对单个延滞期分布的影响提供了重要启示。越来越多的作者关注单个延滞期分布与环境条件（温度、pH、营养物质浓度等）之间的关系。
5.1.2. 其他动力学参数分布
有研究者开发了一个动态连续-离散-连续单细胞模型。事实上，CDC模型是从离散-连续模型改进而来的，在离散-连续模型中，离散事件被定义为单个延滞期的分布，而不是单个细胞的生理状态。为了缓解这个问题，在离散-连续模型中增加了一个连续的适应步骤。通常，非生长细胞和生长细胞三个隔室以及单个细胞的生理状态 pi (i=1,2,3,...,N₀) 构成了CDC模型的结构。该模型通常使用四个参数：N₀，初始群体大小；Nmax，群体最大大小；p₀，平均初始个体生理状态；SDp₀，p₀分布的标准差。
非生长细胞数（NG）与时间（t）的关系：
生长细胞数（G）与时间（t）的关系：
在该模型中，单个细胞的初始生理状态 pi (i=1,2,3,...,N₀) 被假定服从截断的正态分布 N(p₀, SDp₀)，并根据“待完成工作量”的定义，基于稳定期基因产物的减少来定义。
然而，CDC模型的主要局限性在于 p₀ 及其分布必须事先已知。有研究者证明了CDC模型是另一位研究者提出的模型的一个特例。
后来，有研究者提出了一个新的模型，结合了确定性和随机性成分。确定性部分基于另一研究者提出的理论，该理论使用细胞将关键细胞内物质积累到某个阈值所需的时间作为延滞期。在该研究者的模型中，q(t) 表示当前关键物质与阈值物质的比例，该比例以速率 b 增加。
其中 a(t) = q(t)/(1+q(t)) 由细胞的生理状态定义，这些细胞表现出对新条件的适应；μ(N) 是 N 的递减函数，用于描述细胞数如何收敛到环境的承载能力；N 是总细胞数。
在这个确定性-随机性模型中的可变参数是用于世代生成的阈值细胞大小，记为 Xdiv，假定其服从正态分布 N(g, SD)，其中 g 是期望值，SD 是标准差。当细胞大小 X 达到 Xdiv 时，细胞分裂。第一次分裂时间定义为延滞期和第一代时间的总和。因此，随机部分可以表示为：
其中 Xti = 单个细胞 i 的大小；X₀ = 期望的初始细胞大小；N = 细胞数；q₀ = 单个细胞的初始生理状态；μ = 细胞大小的增长率，渐近值为 μs。
5.2. 生长潜力建模
除了个体细胞动力学的变异性之外，个体细胞生长极限也存在变异性。几项研究报告称，初始接种量会影响微生物群体生长边界的变异性。有研究者指出，不生长细胞的比例导致了群体延滞的“伪延滞”，并且还发现，随着鼠伤寒沙门氏菌接种量的减少，NaCl浓度生长极限的变异性增加。在工业加工中，了解单细胞或小接种量的生长潜力非常重要。
有研究者用以下公式确定了半弗雷泽肉汤中单核细胞增生李斯特菌单细胞的生长潜力 P。
其中 ct 是测试条件下的生长细胞浓度，cr 表示参考条件下的生长细胞浓度。
有研究者建立了一个包含温度、pH和aw的单细胞生长概率模型。
其中 r, Tinf, Tsup, pHinf, pHsup, aw,inf 和 aw,sup 是模型参数，P 是单细胞的生长潜力。
以下方程结合了温度、pH和水活度对单细胞生长概率的影响：
5.3. 食品特性建模
最近，有几项研究关注食品性质变异性（aw、pH等的变异性）对单个细胞生长的影响。有研究者将基于个体的建模和食品特性的微观描述结合起来，研究了单核细胞增生李斯特菌在奶酪表面的生长。个体方法将每个细胞视为独立的，并改变生长概率、生理状态和食品特性以及其他环境条件。尽管该模型相对复杂，需要关于食品和微生物的大量数据，但它能够在预测食品上单细胞或少量细胞的行为方面表现良好。
6. 结论与未来趋势
传统的预测方法通常用于高接种水平，这与现实情况相反，实际食品产品很可能被相对较低数量的微生物细胞污染。大多数传统的确定性模型在这些条件下往往会失去精度，因为它们忽略了单细胞的高度异质性。因此，为了提高食品中微生物生长风险评估的准确性，正在开发针对单细胞的随机模型。在早期，单细胞的预测建模主要基于动力学参数的建模，特别是延滞期分布。随后，单细胞生长潜力的变异性成为了一个感兴趣的主题。目前，重点是在真实食品微环境中对单细胞进行建模，这提供了更准确的风险评估。尽管如此，仍有问题有待解决。单细胞预测建模的未来趋势应包括以下几个方面：(1) 应充分阐明控制单细胞行为的内在生物学机制；(2) 应阐明真实食品条件（例如，食品链、食品分销和家庭储存）与细菌生长概率之间的关系；(3) 应开发更方便、更准确、更高效的技术来监测细胞数量和大小，以及细胞内事件（例如，基因表达和蛋白质合成）；(4) 随机模型的参数应侧重于具体的生理状态，而非表观动力学。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金项目（批准号：31401608 和 31271896）的支持。同时，本项目也得到了教育部留学回国人员科研启动基金的资助。