在进入微生物实验室学习的时候,除了无菌操作、培养基制备和灭菌等基础实验外,最先接触的是从土壤中筛选微生物进行微生物的培养和鉴定。那么,从土壤中选择微生物进行研究的原因是什么呢?


微生物的生长发育主要受到营养物、含水量、氧、温度和pH等因子的影响,而土壤恰好满足大部分微生物生长发育的需求:


土壤中含有大量的动植物和微生物残体,能够提供微生物作为碳源、氮源和能源的需求。


土壤中含有大量且全面的矿质元素。


土壤中的水分能够满足微生物对水分的需求。


土壤颗粒间的空隙可满足好氧微生物的生长;在通气条件差的情况下,处于厌氧状态时,又可以满足厌氧微生物的生长。


土壤的pH范围在3.5至10.0之间,大多数处于5.5至8.5,是大多数微生物的适宜生长的pH范围。


土壤温度的变化幅度小而且缓慢,能够适宜微生物的生长。


土壤微生物取样方法步骤


一、准备工作


1.制定采样计划


采样前需要确定好实验目的、采样样地、样品数量、采样方法、采样工具、交通、线路以及天气等情况。通常需要准备一份采样报告,详细记录采样的具体情况,例如采样日期、时间,采样点详细位置(GPS定位),天气状况(气温、降水、湿度、云等)等信息。


2.样地资料收集


确定采样点后,可以提前收集、了解该地的土壤类型、天气资料、水文资料等信息。实际采样前根据所收集的资料进行现场勘查,最终确定确切的采样点。


3.采样器具


3.1采样器具


A.工具类:土钻、铁铲、筛子、镊子、药匙、刷子以及适合特殊采样要求的工具等。


B.器材类:50 mL无菌管、50 mL无菌瓶、美国parafilm封口膜、卷尺、GPS、坡度仪、土壤比色卡、样品箱(具冷藏功能或含干冰)、冰袋、样品袋、一次性手套、口罩、75%酒精、灭菌棉球、无菌水、液氮、干冰等。


C.文具类:样品标签、记号笔、采样记录表等。


D.安全防护用品类:工作服、工作鞋、雨具、安全帽、药品箱等。


3.2注意事项


A.采样工具和盛放土壤样品的容器必须提前灭菌(锡箔纸包裹,高压蒸汽灭菌后,120℃烘箱过夜),避免外源物质干扰;


B.避免使用吸水、会释放溶剂或增塑剂等物质的器具来盛放土壤样品。


二、土壤取样方案


1.位置选择


根据研究目的,进行采样点的选择,采样点的选择应遵循以下原则:


A.采样点土壤类型特征明确,地形相对平坦、稳定,植被良好;


B.坡脚、洼地等具有从属景观特征的地点不宜设置采样点;


C.城镇、住宅、围墙、道路、沟渠、田埂、粪坑、堆肥点、坟墓等地人为干扰大,可能造成土壤特性错乱,使土壤失去代表性,不宜设置采样点;


D.采样点离铁路、公路至少300 m以上;


E.采样点以剖面发育完整、层次较清楚、无侵入体为准,不宜在水土流失严重或者表层土被破坏处设置采样点。


F.不宜在多种土类、多种母质交错分布、面积较小的边缘地区布设采样点。


注意事项:确定采样点后可以使用精准地图或者GPS进行采样点定位,或者在采样点进行标记,便于以后重复取样或者进行比较试验。


2.取样样方设置


土壤横向取样方法示意图:

3.土壤取样操作方法


3.1普通土壤(Bulk Soil)样本取样方法


A.移除土壤表面覆盖物,包括植物、苔藓、可见根系、凋落物以及可见的土壤动物等;


B.对采样器使用酒精棉球擦拭,待酒精挥发完全后,可使用采样样方处土壤浸润采样器。后续每次更换样方均需重复此步骤;


C.同一样方采取多点取样(建议4-5个取样点等量均匀混合为一个样本),去除样品中的植物、可见动物以及石粒等,然后根据土壤情况,选择是否过筛:①推荐过2 mm筛;②一些有机质(如粗腐殖质或泥炭等)不能通过2mm筛,此时可以选择过4-5 mm筛;③如果土壤粘度太大或者含水量太高,可以选择不过筛。


D.将混合好的土壤样本,分装多份(3-5份备份样本),每份3-5 g,标记好样本信息后液氮速冻(如果条件不允许,可置于装有冰/干冰的泡沫盒中,黑暗环境下,尽快运回实验室),随后转移至-80℃冰箱保存,用于测定土壤微生物;另外留出一部分土壤,用于测定土壤理化指标(如有机质、全氮、矿质元素等)。


3.2根际土壤(Rhizosphere soil)样本取样方法


3.2.1作物类(含草地等矮小植物)根际土壤取样方法:


A.采集植物植株(多点取样法),去除根部大块土壤,置于装有冰/干冰的泡沫盒中,黑暗环境下,尽快运回实验室;


B.无菌工作台中,晃动植物根部,去除根部松散的土壤后,使用无菌刷子从根部收集残留土壤,或对植物根部使用无菌水(或PBS缓冲液)振荡(详细参数参考引用文献)洗涤植物根系,洗涤液进行12000 g离心10 min以上收集沉淀(或过0.22μm滤膜,收集滤膜);


C.同一样方多点取样的根际土壤样本等量混合均匀,标记好样本信息后液氮速冻,置于-80℃冰箱保存。


3.2.2林木类根际土壤取样方法:


A.使用土转采集地面下10-20 cm根际土壤,置于装有冰/干冰的泡沫盒中,黑暗环境下,尽快运回实验室;


B.视情况,选择2-5 mm孔径无菌筛网过筛;


C.同一样方多点取样获得的土壤样本等量混合均匀,标记好样本信息后液氮速冻,置于-80℃冰箱保存。

(Nature,2013)


4.样品存储条件


A.避免样品反复冻融,以保证恒定低温效果;


B.注意样品在实验室保存和分析过程中的密封性,以免凝结的水汽或者其他污染源对样品造成污染。


三、样本寄送


A.DNA:总量>500 ng,浓度>20 ng/µl,无明显降解,土壤:2 g;


B.单次送样样本量需≥20个,送样管(冻存管)务必标清样品编号,管口使用Parafilm封口膜密封(防止样本间交叉污染),并将填写完整的送样订单用自封袋密封后,随同样品一起使用干冰运输寄送至公司。


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