讨论
鼠疫耶尔森菌的毒力基因表达受到环境信号的严格调控，包括温度、营养、生长阶段、渗透压和pH。节肢动物载体的典型温度约为26°C，而啮齿动物为37°C，因此温度是鼠疫耶尔森菌感知哺乳动物宿主应激环境的重要信号。温度从26°C升至37°C导致大多数毒力因子的最大表达，包括pH 6抗原、F1抗原、Pla蛋白酶和T3SS。在本研究中，我们分析了ΔrovA突变株在T3SS诱导条件下的转录谱，该条件允许大多数耶尔森菌毒力因子的表达，这些因子是哺乳动物宿主感染所必需的，我们发现ΔrovA突变株中19个T3SS编码基因的表达增强。根据CO92基因组注释，细胞包膜和转运/结合蛋白的基因功能类别是最显著受影响的类别。本研究的RovA调控组与Cathelyn等人先前报道的之间几乎没有重叠，我们认为这种巨大差异可能源于两个根本原因。
首先，细菌在不同的实验条件下生长。在Cathelyn等人的研究中，细菌在BHI培养基中26°C生长，而在本研究中，细菌在37°C无钙化学定义TMH培养基中生长，这是诱导T3SS表达和许多其他哺乳动物成功感染所需毒力因子的条件。RovA调控组在26°C和37°C生长的细菌中可能截然不同，因为RovA本身的表达是温度依赖性的，当细菌在26°C生长至静止期早期时RovA表达达到最大。其次，两项研究中使用的鼠疫耶尔森菌菌株不同。Cathelyn等人使用了生物型Orientalis菌株CO92，而本研究使用了生物型Microtus菌株201，该菌株对人类无毒力，但对小鼠高度致死。先前的报告表明，尽管三种人类致病性耶尔森菌中的rovA序列相同，但小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌的RovA调控组是不同的。这导致建议RovA调控在物种分化后水平转移的遗传物质，因为小肠结肠炎耶尔森菌中许多RovA调控位点在鼠疫耶尔森菌中没有直系同源物，反之亦然。菌株201和CO92的RovA调控组之间可能存在内在差异。
我们进一步通过分析含有相应基因上游启动子序列的系列lacZ融合体的β-半乳糖苷酶活性，证实了T3SS的一些yop基因（包括YopT、YopQ和YopJ）以及两个大操纵子lcrGVH-yopBD和yscABCDEFGHIJKLM的上调。从在T3SS诱导条件下生长的细菌培养物中分析了耶尔森菌效应蛋白YopE、YopM和YopJ，发现ΔrovA突变株中YopE和YopJ的表达显著高于野生型菌株，而YopM似乎在野生型菌株和ΔrovA突变株中表达相等。然而，这些实验数据都不能说明RovA对T3SS的调控作用涉及直接还是间接机制。我们使用纯化的His标记RovA蛋白和含有lcrF基因上游DNA序列、yscABCDEFGHIJKLM和lcrGVH-yopBD操纵子以及psaEFABC启动子（已证明与RovA直接相互作用）的PCR产物进行EMSA实验。
虽然我们可以稳定检测到RovA对psaE启动子序列迁移的抑制，但未观察到对lcrG、yscA和lcrF启动子的抑制。这些结果强烈暗示RovA在T3SS中的调控作用是通过间接机制实现的。基于DNA微阵列分析，lcrF在ΔrovA突变株中的表达水平比野生型菌株高约2倍（补充表S2），这种上调至少应部分促成ΔrovA突变株中T3SS基因表达的增加。Heroven等人分析了RovA依赖性inv基因和rovA本身的转录机制。他们表明RovA可以结合具有高AT丰度和高多聚（AT）延伸频率的区域，并且他们在inv和rovA启动子中未发现RovA识别的强回文序列特征。AraC家族调控因子的许多成员已被证明通常靶向受调控基因的AT富集区。到目前为止，RovA依赖性靶基因转录的分子机制仅对两个基因inv和rovA进行了确定，分析更多靶序列显然需要完全表征RovA结合位点。已证明RovA的结合位点与受调控区域中H-NS保护的序列重叠，RovA可以通过拮抗H-NS介导的inv和rovA表达沉默在假结核耶尔森菌中发挥其调控作用。
我们通过DNA微阵列分析证明，细胞包膜和转运/结合蛋白类别是ΔrovA突变株中最积极调控的基因类别，随后的实验验证表明突变细菌细胞膜在结构和功能上均受到破坏。TEM分析对rovA突变株细胞的可视化显示，许多电子致密颗粒围绕突变细胞，一些细胞已裂解，电子致密物质仍留在许多这些细胞周围，提示当细菌在26°C和37°C Yop分泌诱导或非诱导条件下生长时，细菌膜的构建可能受到严重影响。这些结果再次与我们ΔrovA突变株的转录组谱一致，并证明该突变株中细胞膜构建不当。
细胞膜最重要的功能之一是控制环境物质进入细胞的通透性，以维持细菌细胞质中的稳态并提供对不利环境因素的保护。我们在ΔrovA突变株中观察到的膜通透性降低表明这些细胞中的细菌膜在功能上也受到破坏。OmpC已被牵涉到细胞膜的通透性，突变细菌通透性降低与本研究中ompC基因大幅下调的观察一致。
T3SS可以组装由超过20种蛋白质组成的注射器样结构，称为注射体，跨越细菌膜的两层，从而将效应蛋白递送到宿主细胞中。Cornelis等人最近发表的研究表明，注射体组装由外膜中O-环（外膜环）的形成启动，随后YscD连接到YscC，然后连接脂蛋白YscJ，完成MS环（跨越内膜的下环）的形成。随后，由YscN、K、L和Q组成的ATP酶复合物在注射体的细胞质侧组装。最后，形成由YscF和LcrV组成的针状结构。基于注射体形成的过程，我们推测膜构建的改变可能干扰发生在细菌外膜和内膜的这些顺序过程。ΔrovA突变株中的膜结构可能更有利于YscC和YscD插入膜中，或者可能通过未知机制增强环结构的稳定性，从而促进注射体组装。当膜构建改变时，T3SS的分泌功能也可能受到影响。已知由LcrQ介导的反馈调控机制参与T3SS调控，并在T3SS非诱导条件下抑制Yops的分泌和合成。已证明功能性分泌机器是通过这种反馈调控机制实现Yops完全表达和分泌所必需的。紊乱的膜构建可能影响反馈调控的平衡，导致T3SS转录和表达的显著增强。然而，这些假设需要进一步证实，以阐明膜构建与T3SS组装和功能之间的联系。
对鼠伤寒沙门氏菌slyA突变株转录组和蛋白质组的调查已鉴定出slyA突变株中许多表达改变的位点。尽管使用两种不同方法获得的结果不同，但大多数slyA依赖性基因预测编码膜、周质或分泌蛋白。这些观察结果与我们的结果非常相似，显示鼠疫耶尔森菌中rovA突变导致细胞包膜和转运/结合蛋白基因类别以及T3SS表达增强的差异表达。这表明MarR/SlyA家族调控因子在细胞膜中的调控作用可能极大地促进其作为抗生素耐药性、环境适应性以及抗菌剂和毒力因子产生的全局调控因子的广泛调控功能。
总之，我们证明了RovA在细菌细胞膜的构建和功能中发挥关键的调控作用，并且是维持膜结构和功能正常所必需的。观察到的细菌膜改变伴随ΔrovA突变株中T3SS表达通过未表征的间接机制增强。这向我们表明，紊乱的膜结构可能干扰跨越细胞膜两层的T3SS注射体的功能。这些结果表明，其他在细菌表面输出或嵌入膜中的毒力因子也可能受到影响，包括已被证明受RovA直接调控的inv和psaA。
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