发酵肉制品是通过微生物发酵加工而成的具有独特风味、色泽和质地的肉类产品,其风味独特,深受消费者喜爱,新产品的开发得到了越来越多的关注。发酵肉制品的方式分为自然发酵和人工接种发酵。葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)是一类具有球形或略微椭圆的革兰氏阳性球菌,大多数为非致病菌,少数为致病菌。在肉制品发酵过程中,葡萄球菌常作为发酵剂,其安全特性始终是研究的重点,但是随着人们健康意识的提高,一些新型功能的发酵特性也逐渐得到关注,例如降解胆固醇、生物胺等,这对发酵剂的筛选提出了更高的要求,因此需要发掘具备更多功能特性的葡萄球菌发酵菌株。


南京农业大学食品科技学院的刘思露、陈姗姗、王虎虎*等以传统发酵肉制品中筛选得到的33株葡萄球菌为研究对象,通过触酶和硫化氢等基础生化实验确定出11株菌进入安全性能的筛选;通过溶血、血浆凝固酶和耐热核酸酶等安全性指标进一步确定上述11株菌均符合要求;通过产脂肪酶、降解胆固醇、耐酸、产蛋白酶、降解肌原纤维蛋白、降解亚硝酸盐、降解生物胺等功能性指标筛选出安全性高、功能性全的发酵菌株,以期为筛选肉制品发酵剂提供一定的基础。


1基础生化指标


33株葡萄球菌均为触酶实验阳性,均含有过氧化氢酶。33株葡萄球菌中有11株硫化氢阴性,作为后续筛选的待测菌株。


2安全性指标


本研究中,11株菌在血平板上生长正常,产生单菌落,均未产生溶血现象,为溶血实验阴性。11株菌均未产生凝固现象,瓶体内也未有凝块产生,均为血浆凝固酶阴性。在甲苯胺蓝-DNA酶培养基上均未产生粉红色晕圈,为耐热核酸酶实验阴性。


3功能性指标


3.1产脂肪酶


如图1所示,有8株菌可产生脂肪酶,能够分解脂肪产生脂肪酸,使中性红变色,在培养基中显示红色斑点。通过培养基颜色变化筛选出21株产脂肪酶的葡萄球菌发酵剂。

3.2降解胆固醇


胆固醇质量浓度与吸光度的拟合公式为Y=0.004 78X-0.010 23(X为胆固醇质量浓度(μg/mL),Y为560 nm波长处吸光度,R2=0.998 13),标准曲线拟合度R2>0.99,拟合度较高,拟合程度较好。由图2可知,8株菌均具有降解胆固醇的能力,其中沃氏葡萄球菌5F’-2降解率最高50.05%;琥珀葡萄球菌9P-3降解率相比于其他菌较低,为41.77%;两株之间存在显著差异(P<0.05)。与参考文献研究结果相比,本实验中8株菌降解胆固醇能力较高,基本稳定在40%~50%之间,因此选择此8株菌继续进行后续实验。


3.3耐酸


由图3可得,实验中8株葡萄球菌更适合在偏中性环境生长,酸性条件会在一定程度上影响菌株的生长能力,相同时间内随着pH值的下降,菌液浓度逐渐下降,菌株进入生长对数期的时间逐渐延后。

待测8株菌相对比,5F-2耐酸性能相对最强,A31、8A-1、5F’-2随后,5D-1、C15、9N-1、9P-3耐酸性能较差。随着pH值下降,5F-2虽生长速度减缓,对数期推迟,但是生长趋势一直居首。A31、8A-1、5F’-2在pH 6.0时也表现出相对较强的耐酸性能,虽然相较于5F-2的耐酸性能不足,但是在酸性环境中可以生长。5D-1、C15、9N-1、9P-3对酸性环境较为敏感,在pH 6.5时即表现出相比于其他4株菌较弱的生长状态,在pH 5.0时,连续5 d OD600 nm<0.1,基本处于不生长的状态。因此选择5F-2、A31、8A-1、5F’-2耐酸性能较好的4株菌进入后续的筛选。


3.4分解酪蛋白


本研究4株葡萄球菌在酪蛋白培养基上均形成了透明水解圈(图4),说明4株菌均可产生蛋白酶分解酪蛋白,因此进入下一步胞外蛋白酶活性的筛选,以探究葡萄球菌作为发酵剂能否降解肌肉蛋白。


3.5分解肌原蛋白


不同蛋白因分子质量不同在SDS-PAGE图中显示出来,葡萄球菌胞外蛋白酶对鸡肉肌原纤维蛋白降解作用结果如图5所示。处理组中270、45 kDa和37 kDa左右的3个条带发生了不同程度的降解。270 kDa左右的条带可能是肌球蛋白重链,45 kDa左右的条带可能是肌动蛋白,37 kDa左右的条带可能是肌钙蛋白。相比于空白对照组,4株菌的胞外蛋白酶在上述条带中均发生了降解,条带颜色变浅,说明对肌原纤维蛋白均产生了一定的降解作用,因此4株菌进入下一步功能筛选。


本实验仅对上述筛选所得的4株葡萄球菌进行了胞外蛋白酶降解鸡肉肌原纤维蛋白能力的研究,值得注意的是蛋白质的降解效果受多种因素影响,温度、孵育时间均会导致蛋白质降解效果的差异。另外不同种的葡萄球菌特性不一,不同来源的肌原纤维蛋白也可能会产生影响。


3.6降解亚硝酸钠


亚硝酸钠质量浓度与吸光度的拟合公式为Y=0.006 57X+0.021 31(X为亚硝酸钠质量浓度(μg/mL),Y为538 nm波长处吸光度,R2=0.999 1),标准曲线拟合度R2>0.999,拟合度高,拟合程度好。由图6可知,前述指标中筛选出的4株菌均具有降解亚硝酸盐的能力,其中沃氏葡萄球菌5F’-2降解率最高,为35.76%;琥珀葡萄球菌A31降解率相比于其他菌最低,仅为3.50%;4株菌降解亚硝酸盐的能力相互之间存在显著差异,但是亚硝酸盐降解率可能会影响到肉制品色泽,因此不能单纯的将降解率的高低作为唯一筛选标准,所以具有降解亚硝酸盐的4株菌均保留到下一步筛选中。


3.7降解生物胺


本实验以腐胺、尸胺和组胺标准溶液的衍生化图谱为参考,确定腐胺、尸胺和组胺的出峰位置,腐胺、尸胺和组胺分别于9.67、10.53、11.13 min分离出峰。20 min内所有生物胺衍生物都被洗脱出来。在营养匮乏的情况下,具有氨基酸脱羧酶活性的细菌可能会将氨基酸脱羧形成对应的生物胺改善生长环境,维持自身的正常生长。因此在PBS中只加入对应的氨基酸检验。结果可知,4株菌均不产生物胺。


3种生物胺(腐胺、尸胺、组胺)的标准曲线公式分别为:Y腐胺=37 036.783 36 X-1 119.370 49(X为腐胺质量浓度(μg/m L),Y为峰面积,R2=0.999 9)、Y尸胺=27 296.707 54X+433.799 84(X为尸胺质量浓度(μg/mL),Y为峰面积,R2=0.999 9)、Y组胺=20 047.998 12X-3 894.753 53(X为组胺质量浓度(m g/m L),Y为峰面积,R2=0.9 9 9 9),R2≥0.999 9,拟合程度高,说明该方法成熟可靠,能够定量分析这3种生物胺。由图7可知,4株葡萄球菌中均能够选择性降解生物胺,均能降解腐胺和组胺,4株菌在降解腐胺能力上没有显著差异(P>0.05),其中5F-2和5F’-2降解组胺能力较强,降解率达64%以上,且与另外两株菌形成了显著差异(P<0.05),但是二者却很少降解尸胺,5F’-2的尸胺降解率几乎为0。A31和8A-1虽然对3种生物胺降解率没有明显优势,但是对3种生物胺均能均衡降解,在后续使用中需要根据具体的使用情景确定具体使用菌株,或与其他菌株复配使用。


4生长曲线


自动生长曲线分析仪测定的37℃条件下菌株生长曲线如图8所示。可以看出包括了细菌生长周期中的迟缓期、对数期和稳定期,因测定细菌密度观察不到衰亡期,即测定的48 h内可能包括衰亡期,但衰亡期菌体出现死亡、活菌数量降低、活性减弱,对本实验研究意义不大。4株葡萄球菌在37℃条件下长势良好,在4 h即进入对数期,在10~20 h间即进入稳定期。

结论


首先通过常规基础生化指标和安全性指标对33株葡萄球菌进行筛选,共有11株菌进入功能性筛选,确保了发酵菌株的安全;进而通过降解脂肪、降解蛋白等传统功能指标和降解胆固醇、生物胺、亚硝酸盐等新型功能性指标结合进行发酵特性分析和研究。最终选出沃氏葡萄球菌5F’-2、小牛葡萄球菌8A-1、沃氏葡萄球菌5F-2、琥珀葡萄球菌A31这4株葡萄球菌,均满足触酶实验阳性、不产硫化氢、不发生溶血现象、血浆凝固酶阴性、耐热核酸酶阴性。上述菌株均可产生脂肪酶分解脂肪;均可降解胆固醇,且降解率较高,稳定在40%~50%之间;能耐酸,在pH 5.0的环境下可生长;均产生蛋白酶,可降解肌原纤维蛋白;均可降解亚硝酸钠,降解率排序为5F’-2>8A-1>5F-2>A31;均能够选择性降解生物胺,均能降解腐胺和组胺。生长性能良好,可作为肉制品发酵菌株以便后续研究。


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