摘要
本研究调查了血清型对肠道沙门氏菌菌株生长行为和生物膜形成能力的影响。同时确定了生物膜形成与生长动力学参数之间的关系。共测试了69株菌株（61株来自家禽的分离物和8株来自培养物保藏中心的参考菌株），属于10种血清型（肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型、纽波特沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、浦那沙门氏菌、德比沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、维尔乔沙门氏菌、阿戈纳沙门氏菌和伤寒沙门氏菌）。所有沙门氏菌菌株均在聚苯乙烯微孔板上产生生物膜（结晶紫法）。分离物被归类为弱（35株）、中等（22株）或强（12株）生物膜产生者。
阿戈纳沙门氏菌和伤寒沙门氏菌产生最显著的生物膜（P < 0.001）。生长曲线在37°C的胰蛋白胨大豆肉汤中进行，通过光密度（OD420-580）测量从0到48小时。生长动力学参数（Gompertz模型）在不同血清型之间有所变化。最大生长速率（ΔOD420-580/h）范围从0.030±0.002（伤寒沙门氏菌）到0.114±0.011（阿戈纳沙门氏菌）。沙门氏菌菌株形成生物膜的能力与其生长动力学参数无关。沙门氏菌在聚苯乙烯上形成生物膜是一个值得关注的问题，因为塑料材料经常在食品设施中使用。研究结果表明，当阿戈纳沙门氏菌或伤寒沙门氏菌菌株存在时，必须做出特别努力以有效控制食品加工环境中的沙门氏菌。
1. 引言
沙门氏菌感染被认为是发达和发展中国家的主要公共卫生问题之一，每年在全世界造成数百万人类和动物疾病以及重大的经济损失。在美国，每年有超过一百万的人类疾病可归因于非伤寒沙门氏菌，导致约20,000人住院和400人死亡。2009年，欧盟共报告了108,614例确诊的沙门氏菌病病例，这是人类中第二常见的报告人畜共患病，仅次于弯曲菌病。2009年沙门氏菌感染的报告发病率为每100,000人23.7例。
感染沙门氏菌病有几种途径，但超过95%的由这些细菌引起的人类感染病例是食源性的。当受污染的生食未充分煮熟或在烹饪后交叉污染时，沙门氏菌对人类健康构成风险。
2009年期间，沙门氏菌在欧盟造成了1,722起基于食物的感染暴发（占所有报告食源性暴发的31.0%和所有确认暴发的33.2%），仍然是报告的食源性暴发中最常见的致病因素。同样，沙门氏菌是西班牙最常报告的食源性疾病原因，在2004年至2007年期间造成了约75%的确认食源性暴发。
尽管几种食物与沙门氏菌病有关，但鸡蛋和肉鸡是人类感染中最常见的食物载体，分别在2009年欧盟食源性沙门氏菌暴发中占49.1%和5.2%。根据2009年RASFF（食品和饲料快速预警系统）年度报告，沙门氏菌是最常通报的微生物，其中70%与家禽有关。
生物膜被定义为嵌入自产胞外聚合物基质中的复杂微生物群落，附着在表面上，是自然界中微生物生长的主要模式。与食品接触表面上的生物膜为致病和腐败细菌提供了储存库，增加了食品加工厂的微生物污染风险，并导致严重的公共卫生问题以及潜在的重大经济影响。已证明，在加工过程中，由于细菌存在于与食品接触的表面，受沙门氏菌污染的禽类样品百分比显著增加。
生物膜中的细菌通常受到很好的保护以抵抗环境压力（例如消毒剂），因此极难根除，导致细菌在工业表面和设备上的持久性和抗性。此外，生物膜可以降低热交换设备中的传热和操作效率，增加能耗和机械堵塞次数，并加速金属表面的腐蚀。已发现生物膜中的细菌比浮游细胞对抗生素更具抗性。因此，影响生物膜形成的因素和预防方法目前对家禽加工商、政府官员和消费者来说是至关重要的话题。
过去许多作者评估了沙门氏菌菌株在非生物表面上的细菌粘附和随后的生物膜形成。然而，很少有报告比较从家禽分离的肠道沙门氏菌血清型的生物膜形成能力，并且生长动力学参数与生物膜形成能力之间的关系尚未被探索。本研究的主要目的是比较属于十种不同沙门氏菌血清型的菌株形成生物膜的能力。还评估了测试菌株的生长动力学以及生长动力学参数与形成生物膜能力之间的关系。
2. 材料与方法
2.1. 细菌菌株和培养条件
本研究使用了69株沙门氏菌菌株。其中61株先前从西班牙西北部六个不同屠宰场的鸡胴体中分离，按照ISO-6579-1993规则：肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型（3株）、纽波特沙门氏菌（2株）、乙型副伤寒沙门氏菌（2株）、浦那沙门氏菌（5株）、德比沙门氏菌（1株）、婴儿沙门氏菌（6株）、肠炎沙门氏菌（36株）、维尔乔沙门氏菌（2株）、阿戈纳沙门氏菌（3株）和伤寒沙门氏菌（1株）。血清分型在"西班牙沙门氏菌和志贺氏菌国家参考实验室"进行。8株菌株来自美国典型培养物保藏中心（鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311和伤寒沙门氏菌ATCC 416）、国家培养物典型保藏中心（德比沙门氏菌NCTC 5721和维尔乔沙门氏菌NCTC 574）和西班牙典型培养物保藏中心（乙型副伤寒沙门氏菌CECT 554、婴儿沙门氏菌CECT 700、肠炎沙门氏菌CECT 556和阿戈纳沙门氏菌CECT 705）。
细菌储备培养物保存在含20%（体积/体积）甘油的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，温度为-30°C。在每次实验之前，通过将20 μL储备培养物转移到5 mL TSB中并在37°C下过夜孵育来活化细胞。工作培养物保存在4°C的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上。
2.2. 生物膜形成
使用Stepanovic等人描述的方法测量生物膜产生，并进行了一些修改。在用结晶紫染色和冲洗后，在100孔聚苯乙烯微孔板（Oy Growth Curves Ab Ltd.，赫尔辛基，芬兰）中测定粘附细胞的光密度。使用前，将菌株转移到TSB中并在37°C下孵育5小时。这些细菌培养物含有约10^8 cfu/mL。在TSB中进行三次十进制稀释。用20 μL该细菌培养物的第三次稀释液和230 μL TSB填充孔，以获得孔中10^4 cfu/mL的浓度。通过平板计数确认该细菌浓度。阴性对照（每个平板五个）仅含250 μL TSB。将平板在37°C下需氧孵育24小时。然后倒出平板内容物，用300 μL蒸馏水冲洗孔。通过向每个孔中添加250 μL甲醇15分钟来固定残留的附着细菌。然后排空平板，风干并用每孔250 μL结晶紫染色5分钟。通过将微孔板放在自来水下冲洗去除多余染料。将平板风干，然后用每孔250 μL 33%冰醋酸重新溶解与粘附细胞结合的染料。使用Bioscreen C MBR（Oy Growth Curves Ab Ltd.）在580 nm处测量每个孔的光密度（OD580）。在测量浊度之前，将微孔板摇动一分钟。69株菌株和五个对照都包含在每个微孔板上。所有实验在不同的日子重复三次。
截止OD（ODc）定义为阴性对照平均OD以上三个标准差。菌株被分为三类：当OD ≤ ODc时不是生物膜产生者，当ODc < OD ≤ (2×ODc)时为弱生物膜产生者，当(2×ODc) < OD ≤ (4×ODc)时为中等生物膜产生者，或当(4×ODc) < OD时为强生物膜产生者。通过方差分析（ANOVA）技术检查生物膜形成程度的差异。使用Duncan多重范围检验获得均值分离。显著性水平确定为P < 0.05。
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