结果
sir2缺失细胞中的聚集体遗传缺陷不能用母-子几何形状、聚集体丰度或世代时间的改变来解释
为获得关于聚集体遗传的经验性定量数据集，我们使用了通过Hsp104-GFP检测的热诱导聚集体形成以及易于聚集的亨廷顿病蛋白Htt103Q-GFP（该构建体的详细信息可参见相关文献），与热诱导聚集体相反，Htt103Q-GFP形成小而稳定的聚集体，而不是大的IPOD/JUNQ包涵体（图1A）。减少遗传（例如通过母细胞中的聚集体滞留）和聚集体清除（例如通过解聚或子细胞中聚集体逆行运动）是建立不对称聚集体分布所需的两个过程。图1B显示了如何在实验上区分这两个过程的示意图。通过添加半乳糖诱导HTT103Q（导致Htt103Q聚集）后，用荧光conA（刀豆球蛋白A）缀合物染色细胞，其结合细胞壁中的糖蛋白。在随后添加葡萄糖（抑制进一步HTT103Q表达）期间，conA被洗去。该方案能够区分在HTT103Q表达和聚集体形成期间存在的子细胞（用conA染色）和在关闭聚集蛋白合成后产生的细胞（未用conA染色），后者只有在从母细胞遗传了聚集体（或可能的小聚集成核颗粒）时才能显示聚集体（图1B）。分析所有可见Htt103Q焦点的遗传表明，野生型酵母母细胞在胞质分裂期间以与热诱导聚集体定量相似的方式滞留Htt103Q聚集体（图1C和D），而Sir2的缺失使这种滞留能力降低了约2倍（图1C；p = 0.02）。在实验的时间范围内，我们发现conA染色的子细胞中Htt103Q蛋白几乎没有或没有清除（图1E）。因此，小的易于聚集的疾病蛋白和固有的热诱导Hsp104相关包涵体的不对称聚集体分布的建立都依赖于Sir2，并涉及母细胞中的聚集体滞留。
图1. Sir2蛋白是亨廷顿病模型蛋白HttQ103实现高效母细胞偏向性分离所必需的。A. 野生型细胞的代表性图像（左图用伴刀豆球蛋白A染色），显示在抑制HttQ103- GFP 表达后形成的HttQ103- GFP 聚集体（右图）。比例尺=5毫米。B. HttQ103- GFP 分离实验设计示意图：通过半乳糖诱导 PGAL -HTT103Q基因表达引发HttQ103- GFP 聚集；随后将碳源更换为葡萄糖以抑制其表达，并在下一次出芽过程中记录聚集体的分离情况；母细胞经伴刀豆球蛋白A短暂染色（图中红色圆圈标记），便于识别新出芽体（未染色）。C. 野生型（左图）与Sir2D突变型（右图）细胞在抑制HttQ103- GFP 聚集体形成后的新出芽事件图像；上下两图分别为HttQ103- GFP 与ConA-Alexa Fluor 647的合并图像，比例尺=2毫米；M表示母细胞。D. 野生型与Sir2D细胞中聚集体遗传性的定量分析：对所有母细胞呈现聚集体的新出芽事件进行计数。E. 通过流式细胞术分析Htt103Q聚集体的稳定性：稳定性以Htt103Q- GFP 聚集体信号强度随蛋白质合成抑制时间变化的平均值表示，数据以均值±标准差呈现。非配对双尾t检验证实两种菌株之间存在统计学显著差异（*P<0.05）。
模拟表明，为了允许2倍的遗传增加，假设聚集体通过随机游走移动，母细胞和子细胞之间的出芽颈必须扩大2.2-3.0倍，且世代时间和聚集体数量在野生型和突变型细胞中相似。使用隔膜环组分Shs1-Gfp作为出芽颈的报告蛋白，我们没有发现野生型和sir2缺失突变型细胞的平均和中位出芽颈直径有差异的证据（图2A和B）。此外，Sir2缺陷细胞的世代时间并不比野生型细胞显著更长（图2C）。而且，sir2缺失突变型母细胞的平均长度比野生型母细胞长（图2D），这意味着sir2缺失母细胞中的平均聚集体必须经历更长的旅程才能到达子细胞，如果聚集体分布仅依赖于随机游走，这将在Sir2缺陷细胞中产生更明显的不对称性。最后，野生型和Sir2缺陷细胞中观察到的Htt103Q聚集体的分布和平均数量相似（图2E），热诱导的Hsp104相关聚集体的数量也相似。因此，几何参数、世代时间或聚集体丰度的变化不能解释sir2缺失子细胞中聚集体遗传的增加。
图2. 在Sir2子代细胞中聚集体遗传率的增加无法通过几何参数和世代时间的变化来解释。A. 使用Shs1-Gfp作为报告基因在野生型和Sir2D突变体（黄色箭头）中观察芽颈结构的代表性图像。比例尺=5毫米。B. 野生型（橙色）与Sir2D突变体（红色）细胞群体中芽颈直径的分布情况。C. Sir2D突变体（红色）与野生型（橙色）细胞在液体 YPD 培养基中的生长情况对比，图中显示了各组的世代时间（数据以三次重复实验的平均值表示）。D. Sir2D突变体（红色）与野生型（橙色）细胞群体中母细胞平均长度的分布。E. 野生型（橙色）与Sir2D突变体（红色）细胞群体中每个细胞内蛋白质聚集体（Htt103Q- GFP）数量的分布；P值基于约500个细胞计算得出，采用双尾U检验确定观测差异无统计学意义（P=0.66）。F. 聚集体滞留实验的设计示意图：野生型细胞经低浓度放线菌酮（CHX）处理以延长世代时间。G. 使用指定浓度 CHX 将世代时间延长超过两倍后聚集体的遗传情况；聚集体遗传数据以三次重复样本的平均值±标准差表示。与野生型相比的统计学显著差异通过非配对双尾t检验确定。星号表示样本间存在显著差异：*P<0.05。
被动聚集体扩散模型预测，显示生长速率降低的细胞将遭受通常增加的子细胞聚集体遗传，因为聚集体被允许更长的时间随机找到进入子细胞的路径并与子细胞达到平衡。因此，我们研究了当通过不同浓度的蛋白质合成抑制剂放线菌酮减缓世代时间时，野生型细胞中Htt103Q聚集体遗传能在多大程度上增强。已表明，用低浓度放线菌酮处理的指数培养物不会在任何特定细胞周期阶段停滞，而是以减慢的指数方式生长，细胞周期延长。由于隔膜形成仅在完成有丝分裂事件后发生，暴露于低浓度放线菌酮时出芽颈应保持开放更长时间。Htt103Q-GFP报告蛋白是该实验的有用模型蛋白（参见图2F中的实验原理），因为Htt103Q聚集体在长时间内稳定（不被清除）（图1E），且聚集体形成不涉及温度变化，温度变化会影响扩散速率。分离分析表明，将世代时间延长两倍以上并未导致Htt103Q聚集体遗传的增加（图2G），表明聚集体不对称性的建立不能仅依赖于缓慢和随机扩散。
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