1.2 方法
1.2.1 AIH小鼠模型的建立
饲养ST2敲除小鼠和C57BL/6J小鼠4~6周后，ST2敲除小鼠和C57BL/6J小鼠分别经尾静脉注射ConA（20 mg/kg），8 h后眼球取血，脊椎脱臼法处死，取肝脏。模型的构建及验证在课题组前期工作中已被证实。
1.2.2 血清 ALT及AST测定
4 ℃、12 000 r/min、离心5 min血液2次后，取血清，采用酶比色法在德国罗氏公司cobas 702全自动生化分析仪测定小鼠血清ALT及AST浓度。
1.2.3 肝脏病理HE染色
从处死的小鼠中取肝脏组织约50 mg并固定在10%磷酸盐缓冲甲醛中。然后将样品转移至不同浓度的乙醇和二甲苯中。切片嵌入石蜡并进行HE染色。载玻片制备如下：载玻片用1%甲苯胺蓝复染5 min，并用蒸馏水洗涤，然后使用分级系列乙醇洗涤脱水。加入血红素溶液，用水和盐酸乙醇洗涤后将载玻片维持5 min。然后将切片在37 ℃下用伊红溶液染色5 min，用乙醇脱水并浸入二甲苯中。最后，将载玻片安装在玻璃盖玻片下，并在光学显微镜下进行观察及拍照。
1.2.4 实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析
使用苯酚-氯仿法抽提取小鼠肝脏的总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录获取cDNA，逆转录条件为：在总RNA样本中加入Oligo（dT）引物后充分混匀，PCR仪65 ℃扩增5 min；待反应完成后按试剂说明书加入dNTP、逆转录酶及RNA酶抑制剂等，在PCR仪上42 ℃反应60 min，70 ℃反应5 min后4 ℃保存。目标基因表达水平的检测采用SYBR Green法，以cDNA为模板，扩增条件：95 ℃预变性30 s；随后95 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，重复40个循环。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达水平。
1.2.5 肠道菌群测序
根据试剂盒说明书，采用QIAamp® DNA Stool Mini Kit提取小鼠肠道粪便的总基因组DNA，使用16S rRNA通用引物338F（5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGA- CTACHVGGGTWTCTAAT-3′）进行扩增。纯化后的扩增产物使用MiSeq测序仪进行测序。
1.2.6 肠道菌群多样性分析
测序结果采用Microbial Ecology相关软件和数据库进行分析，包括Prinseq、FLASH、PEAR、Mothur、Usearch、Cytoscape、R和RDP classifier等软件，RDP、Silva和NCBI 16S database等数据库。Chao、ACE、Shannon和Simpson指数由Mothur软件计算产生。菌属多样性分析采用RDP classifier分析软件。菌群分布采用STAMP软件分析。
1.3 统计学分析
采用Graphad Prism 8.0软件作图。采用SPSS26.0软件进行统计分析，数据采用
±s表示，组间资料比较采用两独立样本t检验，以双侧P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 敲除ST2基因表达可减轻ConA诱导的肝炎小鼠肝损伤和炎症
采用ConA将敲除ST2基因小鼠（ST2-/-组）和C57BL/6J小鼠（Control组）诱导成AIH小鼠。结果显示与对照组相比，敲除ST2基因小鼠血清中ALT和AST水平降低（P<0.05，图1A）。同时，对小鼠肝脏进行HE染色，染色结果显示肝脏呈现典型的界面性肝炎、淋巴细胞浸润，符合ConA诱导的AIH小鼠模型，并且发现敲除ST2基因的小鼠肝脏病理损伤较轻（图1B）。最后，对小鼠肝脏中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ等基因的相对表达量进行检测，结果显示敲除ST2基因表达后IL-6的表达量降低（P<0.001，图1C），其他细胞因子表达差异无统计学意义（P>0.05）。
图1 敲除ST2基因表达可减轻ConA诱导的肝炎小鼠肝损伤和炎症
2.2 肠道菌群丰度和α多样性分析
采用ACE、Chao、Richness、Shannon和Simpson指数对小鼠肠道菌群的丰度和α多样性进行分析，结果显示ACE、Chao、Richness、Shannon和Simpson指数在Control组和ST2-/-组之间差异无统计学意义（图2A~J）。表明在AIH小鼠体内敲除ST2基因表达不影响肠道菌群的分布丰度及α多样性。
图2 小鼠肠道菌群丰度和α多样性分析
2.3 肠道菌群β多样性分析及LEfSe分析
利用PCA对小鼠肠道菌群的β多样性进行分析，结果显示，Control组和ST2-/-组小鼠肠道菌群的物种组成无明显差异（图3）。LEfSe分析可以检测到各组小鼠肠道有显著差异的菌群，如图4A、B，设定LDA值为4进行LEfSe分析可得Clostridia、Clostridiales、Lachnospiraceae、unclassified_Lachnospiraceae、BacillalesStaphylococcus、Staphylococcaceae、Saccharibacteria_ genera_incertae_sedis、norank_Candidatus_Saccharibacteria、norank_Candidatus_Saccharibacteria、Candidatus_Saccharibacteria、norank_Candidatus_Saccharibacteria、unclassified_Clostridiales、unclassified_Clostridiales和Clostridium_XVIII在Control组和ST2-/-组差异具有统计学意义（P<0.05）。
图3 肠道菌群PCA分析图
图4 肠道菌群LEfSe分析
2.4 肠道菌群种属差异分析
为进一步观察ST2敲除后对哪些菌群产生影响，对小鼠肠道菌群的种属差异进行分析。结果显示，正常小鼠诱导的肝炎小鼠肠道菌群中占主要的菌属是unclassified_Porphyromonadaceae（22.02%）、Akkermansia（17.87%）和Lactobacillus（14.81%）（图5A），而ST2敲除小鼠诱导的肝炎小鼠肠道菌群中占主要的菌属是unclassified_Lachnospiraceae（25.36%）unclassified_Porphyromonadaceae（21.82%）、Akkermansia（12.07%）（图5B）。Psychrobacter（P=0.045）、Romboutsia（P=0.037）、Rikenella（P=0.036）、unclassified_Clostridia（P=0.030）、Halothiobacillus（P=0.028）、Parabacteroides（P=0.025）、Clostridium_XlVa（P=0.024）、Haemophilus（P=0.018）和unclassified_Clostridiales（P=9.40e-3）菌属在Control组和ST2-/-组之间差异具有统计学意义（图6）。
图5 小鼠肠道菌属分布
图6 肠道菌属分布差异图
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