2. 材料与方法
2.1 研究材料
研究材料为市售生菜和混合物，加工程度最低。研究涵盖了波兰市场领先生产商的五种产品。对于四种即食产品（芝麻菜、胡萝卜混合叶沙拉、甜菜根混合叶沙拉和菠菜（清洗菠菜、未清洗菠菜）），生产商声明原材料在密封包装前已清洗。第五种产品是消费者清洗后的即食菠菜（未清洗菠菜）。测试产品按照生产商推荐的冷藏条件储存（4-5°C）。
2.2 测试的最低限度加工植物性食品产品的微生物学质量评估
在冷藏储存期间评估测试产品的微生物学质量。所有分析均进行生物学三重复，在保质期（到期日前五天）和到期日后48小时进行。微生物学分析包括：嗜冷和/或嗜冷微生物总数（PCA，BTL，波兰）、嗜温微生物总数（PCA，BTL，波兰）、产酸细菌数（乳糖和中国蓝琼脂，BTL，波兰）、大肠杆菌群细菌数（Endo琼脂，BTL，波兰）和肠杆菌科细菌数（VRBG琼脂，BTL，波兰）的测定。此外，对产品进行了病原性大肠杆菌O157:H7、凝固酶阳性葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和阪崎克罗诺杆菌的检测。培养基上生长的菌落被计数并表示为log CFU g⁻¹。
2.3 分离细菌菌株的分类学鉴定
在评估最低限度加工产品的微生物学质量后，选择细菌菌落用于分离纯细菌培养物。由于肠杆菌科细菌污染严重，从VRBG琼脂和Endo琼脂中分离出数十株菌株。反复挑取单菌落并在营养琼脂（PCA，BTL，波兰）上划线，在37°C下培养以确保纯细菌培养，然后进行鉴定。所有菌株保存在-80°C的Luria Bertani肉汤（组成：10 g L⁻¹细菌蛋白胨、10 g L⁻¹氯化钠和5 g L⁻¹酵母提取物；pH 7.2±0.2）中，补充20%甘油。本文介绍了本研究中后来使用的43株细菌宿主菌株的鉴定。菌株保存在工业微生物菌种保藏中心-微生物资源中心。通过16S rRNA基因区域扩增确定物种归属。使用商业DNeasy PowerFood Microbial Kit分离细菌DNA，并使用16S-F和16S-R引物扩增。PCR条件如下：95°C初始变性2分钟，然后进行35个扩增循环（94°C变性30秒、51°C杂交35秒、72°C延伸1分钟），最后72°C延伸10分钟。扩增子在含SimplySafe干扰化合物的1.5%琼脂糖凝胶上通过电泳分离。使用100-3000 bp范围的DNA Ladder估计扩增子大小。电泳在80V下进行60分钟。使用GeneFlash Network Bio Imaging System可视化条带。测序外包给Genomed S.A.公司。使用BLASTn分析原始序列并存入GenBank数据库。此外，使用MALDI-TOF-MS分析蛋白质组学谱进行细菌菌株的分类学鉴定。
2.4 抗菌敏感性测试
对细菌菌株进行28种抗菌药物的体外敏感性测试。按照EUCAST和CLSI标准，使用Kirby-Bauer纸片扩散法在Mueller-Hinton琼脂上进行抗菌敏感性测试。平板在37°C下孵育18±2小时。测试了属于八个不同类别的以下抗菌药物：（1）青霉素类：氨苄西林、舒巴坦/氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸；（2）头孢菌素类：头孢吡肟、头孢噻肟、头孢洛林、头孢他啶、头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、头孢曲松；（3）碳青霉烯类：厄他培南、亚胺培南、美罗培南；（4）单环β-内酰胺类：氨曲南；（5）氟喹诺酮类：环丙沙星、培氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、诺氟沙星；（6）氨基糖苷类：阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素；（7）苯酚类：氯霉素；（8）磺胺类：复方磺胺甲噁唑/甲氧苄啶。测试进行三重复，计算抑制区的平均直径。根据EUCAST指南的解释标准，通过测量抑制区将分离株对抗菌药物的敏感性分类（敏感或耐药）。使用大肠杆菌ATCC 25922作为参考菌株。对三种或更多不同抗菌药物类别耐药的细菌菌株被归类为多重耐药（MDR）分离株。
对显示对两种以上抗生素耐药的细菌菌株记录多重抗生素耐药（MAR）表型，并计算MAR指数：
MAR = 抗生素耐药数量 / 测试抗生素总数
2.5 β-内酰胺酶产生菌株的表型检测筛选
对细菌菌株产生β-内酰胺酶的能力进行表型评估。使用双纸片协同试验在Mueller-Hinton琼脂上进行ESBL产生（超广谱β-内酰胺酶）菌株的表型检测，使用阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟和头孢他啶纸片。当头孢噻肟或头孢他啶周围的抑制区向中心的阿莫西林/克拉维酸纸片增大时，样品被分类为ESBL阳性。此外，使用商业选择性培养基检测ESBL和碳青霉烯酶产生菌株：CHROMagar ESBL和CHROMagar mSuperCARBA。使用大肠杆菌ATCC 25922作为阴性对照。
2.6 噬菌体分离、纯化和扩增
噬菌体从城市污水中分离，污水收集自波兰华沙附近Izabelin "Mokre Łąki"污水处理厂。将25 mL城市污水以10,000×g离心（20°C，10分钟）以分离有机和无机颗粒与细菌和潜在噬菌体。使用0.22 μm膜孔径的注射器过滤器过滤上清液。然后，将20 mL含污水中噬菌体的过滤上清液转移到20 mL双倍浓缩T-肉汤中。含噬菌体的培养基接种1 mL在Luria Bertani肉汤上过夜培养的细菌菌株，并在37°C下孵育24小时。之后，将培养物以8,000×g离心10分钟以分离细菌与增殖的噬菌体。使用0.45 μm膜孔径的注射器过滤器过滤上清液，并与20%甘油一起冷冻保存（-80°C）。
2.7 噬菌体对细菌宿主的裂解活性评估
使用双层平板法测定噬菌体对分离细菌菌株的裂解活性。将含溶解LCA的玻璃管置于48°C水浴中直至温度平衡。然后，向无菌试管中添加100 μL 0.025 M CaCl₂和0.025 M MgSO₄，并与100 μL过夜细菌培养物一起孵育。然后，将500 μL稀释的噬菌体裂解液转移到试管中。20分钟后，向试管中添加4 mL软LCA琼脂（48-52°C），混合，然后倒在第一层营养琼脂上，在37°C下孵育24小时。用于测量噬菌体滴度的单位是每mL噬菌斑形成单位（PFU mL⁻¹）。用手术刀切割单个噬菌体（透明有或无晕圈或浑浊）噬菌斑，并在SM缓冲液中纯化。纯化进行四轮单噬菌斑传代，以确保分离株代表克隆噬菌体群体。此外，通过0.45 μm膜孔径的注射器过滤器过滤后，接种每个裂解液以检查可能的细菌细胞污染。为每个细菌菌株制备生长曲线。为此，每小时将收获的培养物接种在PCA培养基上，在37°C下孵育24小时，同时测量光密度。确定光密度与细菌细胞数量的关系（进行三重复）。接下来，使用以下公式计算每个菌株的比生长速率系数：
μ = (ln ODmax - ln ODmin) / t
其中ln ODmax——指数生长期培养物光密度最大值的自然对数；ln ODmin——指数生长期培养物光密度最小值的自然对数；t——指数生长期持续时间（小时）。
一旦确定噬菌体滴度并绘制细菌宿主生长曲线，使用Bioscreen C自动生长曲线分析仪测量细菌生长动力学。细菌在Luria Bertani肉汤中增殖。培养物以1:100的比例稀释在新鲜培养基中，添加CaCl₂和MgSO₄，最终浓度均为0.01 M。为确保感染复数（MOI）系数的最优值，将新培养物的烧瓶在37°C下连续振荡孵育，直至达到取决于噬菌体滴度的所需光密度。然后，将每种培养物的180 μL移入多孔板中，在Bioscreen C中于37°C下孵育，直至光密度比对照培养基增加OD600~0.1。制备噬菌体裂解液，使MOI系数值分别达到1.0和0.1。然后，向孔中添加20 μL相应的噬菌体裂解液，在20°C下放置15分钟以使噬菌体吸附到宿主细胞表面，然后在37°C下孵育24小时。仪器每15分钟自动测量光密度，波长范围为420至580 nm，每次读数前振荡15秒。对每个菌株和感染率进行10次重复测试。
2.8 噬菌体混合物对分析的即食食品产品的应用
整个研究基于专有方法。噬菌体混合物是43种分离的噬菌体的混合物，具有已知滴度的裂解液。在感染产品之前，通过0.45 μm膜孔径的纤维素注射器过滤器过滤噬菌体混合物。制备的噬菌体混合物的滴度等于2.1×10⁸ PFU mL⁻¹，这是制备混合物中所有噬菌体的平均数量。以两种方式感染产品。第一种方式，将50 g产品应用于聚苯乙烯托盘，并直接喷洒（5 mL）噬菌体混合物。将制备的样品在保护气氛中包装。第二种情况，将浸渍有噬菌体悬浮液的纤维素吸收垫（容量2500 mL m⁻²，5 cm × 4 cm；5 mL噬菌体混合物）放置在聚苯乙烯托盘上。然后，应用50 g产品并在保护气氛中包装。所有样品在20°C下储存。在实验的第0、6、24和48小时，在营养琼脂上进行三重复测量细菌总数（TNB）的变化。同时，进行对照样品（不添加噬菌体混合物）。
2.9 统计分析
使用Statistica 13.3软件套件对获得的数据进行统计评估。对每个微生物学分析和每个即食食品产品独立进行方差分析（ANOVA），然后进行Tukey检验事后分析（p<0.05），以定义同质组，在表中用相同字母标记。在噬菌体混合物实际应用分析中，进行置信区间为0.95的双向方差分析。