CFU测定
白色念珠菌感染后第3天和第7天，切除伤口组织并在无菌PBS中匀浆。将样品涂布在YPD琼脂上，测定真菌菌落计数。结果按组织重量标准化。
组织学检查
损伤后第3天和第7天，从安乐死小鼠切除伤口组织，在10%福尔马林中固定24小时，处理并包埋在石蜡中。将4微米垂直切片固定到玻璃载玻片上，进行苏木精和伊红（H&E）、过碘酸希夫（PAS）、Gomori三色、髓过氧化物酶（MPO；第3天）和Iba-1染色，分别检查组织形态、真菌形态、胶原蛋白沉积、中性粒细胞浸润和巨噬细胞样细胞。使用Olympus AX70（梅尔维尔，纽约州，美国）显微镜通过光学显微镜检查载玻片，使用QImaging Retiga 1300数码相机（伯纳比，不列颠哥伦比亚省，加拿大）和QCapture Suite V2.46软件（QImaging）获取图像。
延时显微镜
白色念珠菌在补充胎牛血清（FCS）的培养基中生长时，通过出芽快速进行细胞分裂并形成假菌丝和菌丝。因此，使用活细胞成像评估NO-np对白色念珠菌细胞分裂和形态转化的影响。简要步骤如下：将10⁶个酵母接种在MatTek板的多聚赖氨酸包被盖玻片底部。使用配备Axiocam MR相机的Zeiss Axiovert 200M倒置显微镜在40×下收集2小时的图像，由Axio Vision 4.4软件（Carl Zeiss Micro Imaging，纽约州）控制。该显微镜置于有机玻璃箱中，使用强制空气加热系统将温度稳定在37°C。将平板盖保持在原位以防止蒸发，并将5% CO₂输送到培养皿上方的腔室。将图像编译成电影，然后用于分析白色念珠菌的形态发生。
丝状白色念珠菌SC5314对NO-np的敏感性
为了评估NO-np对侵袭性白色念珠菌丝状形态的抗真菌活性，将10⁶个酵母在96孔微量滴定板上补充FCS的100 μL培养基中培养。平板在37°C和5% CO₂下孵育4小时。菌丝形成后，向每个孔中添加100 μL补充FCS的含NO-np或np（5 mg/mL）的培养基。然后，平板在37°C和5% CO₂下孵育24小时。对照包括含未处理丝状真菌的孔。通过2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑鎓-氢氧化物（XTT）还原测定法测量代谢活性。
XTT还原测定
对于丝状白色念珠菌SC5314，向每个孔中添加50 μL XTT盐溶液（PBS中1 mg/mL）和4 μL甲萘醌溶液（丙酮中1 mM；Sigma）。微量滴定板在37°C下孵育5小时。活细胞中的线粒体脱氢酶将XTT四唑鎓盐还原为XTT甲臜，导致比色变化，在492 nm处用微量滴定读数器测量。含热灭活真菌或仅含培养基但不含丝状白色念珠菌细胞的微量滴定孔用作阴性对照。通过测量暴露于np或NO-np的真菌相对于未暴露生物膜的OD来确定代谢活性的百分比。
统计分析
所有数据使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software，拉霍亚，加利福尼亚州，美国）进行统计分析。通过方差分析计算P值，并使用Bonferroni校正进行调整。P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
NO-np抑制白色念珠菌生长
实时测定白色念珠菌SC5314在有和没有NO-np暴露下的生长24小时（图1）。与未处理的对照相比，NO-np在共孵育2小时后显著降低真菌生长（P<0.001）。值得注意的是，用np培养的白色念珠菌在4小时时真菌生长显著减少，这种效应可能是由于空间位阻干扰细胞间接触或通讯（如群体感应）。壳聚糖掺入np中也可能提供一定程度的抗真菌活性；尽管用于生成np的浓度可忽略不计。当纳米化时，壳聚糖具有更高的表面积与体积比，转化为更高的表面电荷密度，以及对细菌和真菌的更高亲和力，具有更强的抗菌活性。因此，在纳米尺度上，使用的浓度可能赋予一些抑制活性。然而，NO-np在>4小时时相对于np对照显著阻碍生长（P<0.001）。
图1. 使用Bioscreen C生长曲线分析仪确定NO-np对白色念珠菌生长动力学的影响。白色念珠菌在没有（未处理）或有含NO的纳米颗粒（NO-np）或不含NO的纳米颗粒（np）存在下培养。每个点代表三次测量的平均值。P<0.001，比较np或NO-np处理组与未处理组。P<0.001，比较np处理组与NO-np处理组。该实验进行了两次，每次结果相似。
NO-np在体内增强烧伤愈合
研究了NO-np对白色念珠菌感染后Balb/c小鼠烧伤愈合的影响（图2）。NO-np治疗小鼠的愈合过程进展最快（图2A），烧伤损伤和感染后20天内所有治疗小鼠完全愈合（P<0.001；图2B）。相比之下，未治疗或np治疗小鼠的愈合过程显著延迟（图2A），在损伤后20天内未实现完全伤口闭合，此时对小鼠实施安乐死（图2B）。值得注意的是，对照组动物经历了真菌从烧伤部位向爪子的传播，可能是通过抓挠感染损伤（图2C），这与较高的真菌负荷和延长感染一致。
图2. NO-np在白色念珠菌诱导的烧伤感染中的愈合效果。（A）未治疗、np治疗和NO-np治疗的Balb/c小鼠烧伤损伤，第0、1、5、10和15天。标尺=5 mm。每组使用五只动物。这些实验进行了两次，结果相似。（B）Balb/c小鼠皮肤损伤的烧伤面积闭合相对于初始5 mm伤口。时间点是六个不同伤口测量结果的平均值，误差线表示标准差。P<0.001，比较np或NO-np治疗组与未治疗组。P<0.001，比较np治疗组与NO-np治疗组。这些实验进行了两次，结果相似。（C）NO-np防止小鼠皮肤念珠菌病的传播。每个时间点每组三只动物。
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