白色念珠菌是医院环境中烧伤感染的主要真菌病因，而脓毒症是严重烧伤后死亡的主要原因之一。烧伤病例中侵袭性念珠菌病的患病率差异很大，但占严重感染的3-23%，死亡率从14%到70%不等。因此，我们必须开发这种真菌不太可能产生耐药性的创新治疗药物，从而减少相关发病率和死亡率，最终提高我们治疗这些感染的能力。最近开发了一种廉价且稳定的一氧化氮释放纳米颗粒平台。已知一氧化氮具有直接抗真菌活性、调节宿主免疫反应和显著调控伤口愈合的功能。在本研究中，我们假设NO-np将是治疗白色念珠菌烧伤感染的有效疗法。使用小鼠烧伤模型，NO-np在体内显示出对白色念珠菌的抗真菌活性，很可能是通过抑制其生长和形态发生来实现的，正如体外实验所证明的那样。NO-np对真菌的酵母形态和丝状形态均表现出有效的抗菌活性。此外，我们证明与对照组相比，NO-np显著加速了皮肤烧伤感染的伤口愈合速率。受影响组织的组织学评估显示，NO-np治疗改变了白细胞浸润，最小化了真菌负荷，并减少了胶原蛋白降解，从而为治疗药物的生物活性提供了潜在的机制。综合这些数据表明，NO-np有潜力作为一种新型局部抗真菌药物，用于治疗皮肤烧伤感染。
引言
脓毒症是严重烧伤损伤后死亡的主要原因之一。据估计，在所有入院烧伤中心的烧伤患者中，微生物感染率从30%到63%不等，其发生率还与损伤严重程度和住院时间相关。引起脓毒症的微生物通常是细菌，包括铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌；然而，念珠菌属（其中白色念珠菌最为常见）约占所有病例的8%。烧伤伤口定植和念珠菌属局部感染可进展为全身性疾病。烧伤病例中侵袭性念珠菌病的患病率约占严重感染的23%，死亡率从14%到70%不等。
我们最近开发并表征了一种基于硅烷水凝胶的廉价且稳定的一氧化氮释放纳米颗粒平台。该技术有潜力作为一种新型、易于应用的局部递送系统，用于递送一氧化氮等抗菌药物，可用于治疗复杂的皮肤感染和伤口。在生理和病理条件下，一氧化氮通过调节循环、紫外线介导的黑素生成和晒伤红斑来维持皮肤稳态，这些都参与维持皮肤作为抵御微生物的保护屏障。值得注意的是，一氧化氮还调节免疫反应，是伤口愈合的重要调节因子。事实上，NO-np用于一氧化氮持续递送的简单性和稳定性使其成为许多疾病非常有吸引力的治疗方式。这得到了我们先前工作的支持，该工作证明了NO-np在体外对多重耐药细菌具有强大的功效，这些细菌目前正挑战许多成功的抗生素疗法。Ghaffari等人证明，即使该真菌具有高度可诱导的一氧化氮防御机制，一氧化氮对白色念珠菌仍然有效。基于我们先前的工作以及一氧化氮可以轻松穿过大多数（如果不是全部）生物屏障的事实，我们假设NO-np在体内对白色念珠菌具有杀真菌作用。因此，NO-np可能是治疗由这种真菌引起的烧伤感染的有效手段。为了验证这一假设，我们使用小鼠烧伤感染模型研究了NO-np对白色念珠菌的生物学影响。
材料与方法
白色念珠菌
白色念珠菌SC5314从M. Ghannoum（克利夫兰，俄亥俄州，美国）处获得。除非另有说明，该分离株在酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖（YPD）肉汤（Difco Laboratories）中培养，含10 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖，在摇床（150 rpm）中于30°C孵育24小时（至早期静止期）。
NO-np的合成
使用原硅酸四甲酯、聚乙二醇、壳聚糖、葡萄糖和亚硝酸钠的混合物在0.5 mM磷酸钠缓冲液（pH 7）中合成水凝胶/玻璃复合材料。亚硝酸盐在基质中被葡萄糖的热生电子还原为一氧化氮。氧化还原反应后，将成分混合并使用冷冻干燥机干燥，结果得到含有NO的纳米颗粒细粉。NO-np在室温下以这种形式保持稳定超过1年。一旦暴露于水环境，复合材料的水凝胶特性允许颗粒内部的水通道打开，促进被困NO在延长时间内的释放。还制备了不添加NO的纳米颗粒（np），作为对照。
白色念珠菌SC5314对NO-np的敏感性
为了确定NO-np对白色念珠菌的影响，将1 mL YPD肉汤接种在YPD琼脂上生长24小时的真菌菌落。将100 μL白色念珠菌肉汤悬浮液接种到200孔板的每个孔中，含100 μL含NO-np或np（5 mg/mL；纳米颗粒的一氧化氮动力学释放：峰值状态：18.75 nM；稳定状态：12.5 nM）的YPD肉汤。然后将接种的平板在37°C下孵育24小时。对照包括仅含酵母悬浮液的孔，以及含np的YPD肉汤中的酵母细胞。使用全自动微生物生长曲线分析仪（Bioscreen C，美国生长曲线公司）在600 nm OD下每30分钟评估一次生长。
体内烧伤损伤和感染模型及NO-np治疗
为了研究NO-np在白色念珠菌诱导的烧伤感染中的抗真菌功效，对雌性Balb/c小鼠（6-8周；国家癌症研究所，弗雷德里克，马里兰州，美国）进行麻醉（氯胺酮-赛拉嗪混合液），去除背部毛发，用碘伏清洁暴露的皮肤。使用加热60秒的铜棒施加45秒，创建5 mm直径的烧伤损伤。损伤后立即，使用PBS中制备的10⁷细胞悬浮液将白色念珠菌接种到烧伤组织上。动物单独饲养以防止交叉感染。感染后第1天，涂抹5 mg NO-np或np粉末。在损伤后第3天和第5天进行类似涂抹。未治疗的受伤小鼠用作额外对照。为监测愈合，每天拍照。此外，使用卡尺每天盲法测量损伤的烧伤直径，由两名独立研究人员进行。感染后第3天和第7天，对小鼠实施安乐死并取组织活检。