摘要
目的： 探索枯草三十七肽（Sublancin）单用及其与万古霉素联用对耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus, VRE）的抗菌活性，并阐明其逆转万古霉素耐药性的分子机制。方法： 采用微量肉汤稀释法结合Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪测定枯草三十七肽和万古霉素对携带vanA耐药基因簇的VRE菌株的最小抑菌浓度（MIC）；通过棋盘法药敏试验评估两药联用的协同效应并计算部分抑菌浓度指数（FIC）；利用Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪动态监测联合用药的杀菌动力学特征；借助荧光定量PCR技术检测vanA基因簇中关键耐药基因的表达变化。结果： Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪测定显示，枯草三十七肽对VRE的MIC为160 μg/mL，万古霉素单用MIC为320 μg/mL；两药联用时FIC值为0.2656，呈现显著协同抗菌作用；Bioscreen生长曲线分析显示联合用药组在整个处理期间均保持稳定的抑菌活性，优于任一单药组；荧光定量PCR结果表明，联合用药可显著抑制vanR、vanS、vanH、vanA、vanX、vanY及vanZ等耐药基因的表达上调。结论： 枯草三十七肽不仅自身对VRE具有直接抑菌活性，更能够通过干扰vanS感应系统、阻断vanA耐药基因簇的激活，从而恢复VRE对万古霉素的敏感性，为临床解决万古霉素耐药难题提供了新的策略。
1 引言
抗生素的广泛应用在拯救无数生命的同时，也催生了日益严峻的细菌耐药性问题。万古霉素作为糖肽类抗菌药物的代表，长期以来被视为治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等革兰氏阳性菌感染的"最后防线"。然而，随着临床使用的普及，耐万古霉素肠球菌（VRE）的出现使这道防线岌岌可危。VRE不仅可导致皮肤软组织感染、泌尿道感染、心内膜炎及脓毒血症等多种严重疾病，更因其携带的可移动耐药质粒能够通过水平基因转移将耐药性传播给其他革兰氏阳性菌，对公共卫生安全构成重大威胁。
VRE的耐药机制主要由van基因簇介导，其中vanA型最为常见。该基因簇编码的双组分调控系统VanS/VanR能够感知万古霉素的存在，进而激活下游vanHAXYZ等基因的表达，使细菌细胞壁前体肽聚糖末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸（D-Ala-D-Ala）被D-丙氨酰-D-乳酸（D-Ala-D-Lac）取代。由于万古霉素与D-Ala-D-Lac的结合亲和力较正常靶点降低约1000倍，细菌由此获得高水平耐药。目前，针对VRE感染的治疗选择极为有限，开发新型抗菌药物或耐药逆转剂已成为当务之急。
枯草三十七肽（Sublancin 168）是一种由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168菌株产生的糖肽类抗菌肽，属于糖蛋白（Glycocin）家族。该肽由37个氨基酸残基组成，分子量约3900 Da，其结构中含有两个α-螺旋和一个连接环区，环区第22位半胱氨酸通过罕见的S-糖苷键连接葡萄糖分子，同时两对二硫键（Cys7-Cys36和Cys14-Cys29）赋予其极高的化学稳定性——可在pH 1.5-9.5范围内保持稳定，耐受121°C高温3分钟而不失活，水溶液中室温储存两年仍维持活性。2022年11月，该产品以新饲证字[2022]04号获批为我国新饲料添加剂，由中农颖泰林州生物科园有限公司以枯草芽孢杆菌CGMCC 15404为生产菌种，经液体发酵、膜分离、浓缩及干燥等生物技术工艺制备，适用于肉鸡养殖。
近年来研究发现，枯草三十七肽对多种革兰氏阳性菌具有良好的抑制活性，且可能通过与其他抗菌药物联用发挥协同效应。本研究旨在系统评价枯草三十七肽及其与万古霉素联合应用对VRE的抗菌效果，并从分子水平探讨其逆转万古霉素耐药性的作用机制，为开发新型抗VRE感染药物提供实验依据。
2 材料与方法
2.1 仪器与设备
Bioscreen C PRO全自动微生物生长曲线分析仪（芬兰Bioscreen公司），该仪器配备10×10孔蜂窝板，可同时检测200个样品，具有宽波段滤光片（420-580 nm）及标准滤光片（405、420、450、492、540、580、600 nm），温控范围15.0-65.0°C，精度±0.1°C，培养时间最长可达1600小时，支持培养振荡测量同步进行。
2.2 菌株与培养基
实验用耐万古霉素屎肠球菌（VRE）由河南农业大学药理课题组提供，经二代全基因组测序证实携带vanA耐药基因簇。培养基包括BHI肉汤培养基（牛肉粉1.5 g/L、可溶性淀粉1.5 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L）和MHB肉汤培养基（牛肉粉6.0 g/L、可溶性淀粉1.5 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L）。
2.3 药物配制
枯草三十七肽母液（2560 μg/mL）：精密称取0.0256 g枯草三十七肽粉末，以无菌水定容至10 mL。万古霉素母液（10240 μg/mL）：精密称取0.1024 g万古霉素粉末，以无菌水溶解并定容至10 mL。