1材料与方法
1.1材料与试剂
大肠杆菌ATCC 25922菌株保存于华南理工大学食品科学与工程学院。龙脑精油由广东华清园生物科技股份有限公司提供。
LB肉汤培养基和技术琼脂粉，广东环凯微生物科技公司生产；二甲基亚砜（AR级），上海易恩化学技术有限公司生产；结晶紫（AR级），天津市大茂化学试剂厂生产；氯化钠（AR级），上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产；D-无水葡萄糖（AR级），上海易恩化学技术有限公司生产；蛋白胨（AR级），英国Oxoid公司生产。
1.2仪器与设备
二级分子蒸馏设备MDS80-Ⅱ，广州浩立生物科技有限公司生产；气相色谱-质谱联用仪Agilent 8890-7000 D，安捷伦科技有限公司生产；数显恒温摇床，常州澳华仪器有限公司生产；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司生产；全自动微生物生长曲线分析仪，Bioscreen C 公司生产。
1.3方法
1.3.1龙脑精油的切割分离及成分分析
取龙脑精油原油加入进料瓶，在蒸馏温度80℃，真空度400 Pa、刮膜速度250 r/min下，分别收集轻组分和重组分。
采用正己烷作溶剂，精油样品质量浓度约为300μg/mL，用过量无水硫酸钠除水（静置8 h以上），用0.22μm有机系滤膜过滤制得液态精油样品。安捷伦色谱瓶装1 mL样品进行GC-MS检测。
GC条件：HP-5MS弹性石英毛细柱管（30 m×0.25 mm×0.25μm）。分流比为20∶1，进样量1μL，载气为He，流速1.0 mL/min。升温程序：进样口温度250℃，起始温度50℃，保持1 min，升温速率5℃/min，升至250℃，保持10 min。
MS条件：电子轰击离子源（EI）接口温度280℃，离子源温度230℃，发射电流100μA，电子能量70 eV，检测器电压1 000 V，溶剂延时8 min，扫描质量范围33~450 u。
根据上述GC条件和MS条件对样品进行GC-MS分析，得到龙脑精油原油、轻组分和重组分的总离子流图；对应的质谱图经美国NIST 14.L标准质谱库检索及人工解析确定各化学成分，将峰面积归一化计算精油中各化合物的相对质量分数。
1.3.2龙脑精油溶液的制备
将3种不同组分的龙脑精油分别按照体积比1∶1的比例溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，用0.22μm的有机膜过滤除菌，装于棕色玻璃瓶密封备用。
1.3.3细菌的活化
从4℃冰箱中取出冷冻保存的大肠杆菌ATCC 25922，挑取单菌落划线培养于LB琼脂培养基中。置于37℃恒温培养箱中倒置培养24 h后，挑取平板中的单菌落接于装有2 mL LB液体培养基的摇菌管中，在37℃、200 r/min的气浴恒温振荡器上过夜培养。培养后的菌悬液置于4℃冰箱中备用。
1.3.4最小抑菌浓度与最小杀菌浓度的测定
本实验采用二倍稀释法测定龙脑精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度。将3种不同组分的龙脑精油分别都按照体积比1∶1的比例溶解在DMSO中，用0.22μm的有机膜过滤除菌，再加入灭过菌的LB肉汤，得到体积分数为10%的原油、轻组分、重组分精油溶液。将上述溶液取200μL加入96孔板的第1列，再往第2到7列的孔各加入100μL，从第1列的孔中取出100μL溶液加入第2列中，依次进行二倍稀释，最后1列吸出100μL溶液；接着在每孔中加入100μL过夜培养稀释100倍后的菌悬液，最后原油、轻组分、重组分精油溶液浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25μL/mL。设置LB肉汤为阴性对照组，每个样品做3个平行。将96孔板在37℃静置培养24 h，以不发生浑浊变化且与空白对照无明显差异的浓度作为龙脑精油对大肠杆菌的最低抑菌浓度。
取上述肉眼观察无明显浑浊的浓度及前后两个浓度的菌液各100μL均匀涂布于LB琼脂平板中，在37℃下倒置培养24 h，观察平板中菌落的生长情况。菌落数不超过5个的精油浓度即为最低杀菌浓度，每个样品做3个平行。
1.3.5大肠杆菌生长曲线的测定
将不同组分龙脑精油溶液分别加入菌悬液中调整其终浓度为最低抑菌浓度（MIC）和1/4 MIC，无龙脑精油处理的菌悬液为对照组。在37℃、200 r/min的摇床上培养，每2 h取200μL于新的透明96孔酶标板中，利用全自动微生物生长曲线分析仪测定D（600），连续测14 h，每个样品做3个平行。
1.3.6大肠杆菌泳动与丛动实验
在装有300 mL蒸馏水的锥形瓶中加入3.0 g胰蛋白胨、1.5 g氯化钠和0.9 g琼脂粉末，搅拌均匀至液体澄清，封上封口膜后置于高压灭菌锅，在121℃、101 kPa条件下灭菌15 min，待其冷却至50~60℃，倒入平板制成泳动培养基。
在装有300 mL蒸馏水的锥形瓶中加入2.4 g胰蛋白胨、2.4 g氯化钠、1.2 g酵母提取物、1.5 g葡萄糖和1.5 g琼脂粉末，搅拌均匀至液体澄清，封上封口膜后置于高压灭菌锅，在121℃、101 kPa条件下灭菌15 min，待其冷却至50~60℃，倒入平板制成丛动培养基。
在泳动培养基约60℃时分别加入3种龙脑精油溶液，充分混匀，调配至浓度为MIC、1/2 MIC和1/4 MIC，同时设置无龙脑精油的泳动培养基为对照组，每个培养皿倒入约15 mL泳动培养基，待泳动培养基凝固后，风干培养基表面的水分。将5μL处于对数生长期的菌液滴在平板中心，待琼脂吸干菌液后置于37℃恒温培养箱中倒置培养24 h。每个浓度设置3个平行，待培养结束后观察并用十字交叉法测量以接种点为中心的细菌泳动圈的大小。
在丛动培养基约60℃时分别加入3种龙脑精油溶液，充分混匀，调配至浓度为MIC、1/2 MIC和1/4 MIC，同时设置无龙脑精油的丛动培养基为对照组，每个培养皿倒入约15 mL丛动培养基，待丛动培养基凝固后，风干培养基表面的水分。将5μL处于对数生长期的菌液刺入平板中心，置于37℃恒温培养箱中倒置培养24 h。每个浓度设置3个平行，待培养结束后观察并用十字交叉法测量以接种点为中心的细菌丛动圈的大小。
大肠杆菌泳动和丛动的抑制率计算公式为
泳动或丛动能力抑制率=（S1−S2）/S1×100%
式中：S1为对照组的细菌泳动圈或丛动圈的面积，mm2；S2为实验组的细菌泳动圈或丛动圈的面积，mm2。
1.3.7大肠杆菌生物被膜的测定
本实验采用结晶紫染色法测定龙脑精油对大肠杆菌的被膜生长能力。首先在96孔板中将龙脑精油溶液取200μL加入96孔板的第1列，再往第2到4列的孔各加入100μL，从第1列的孔中取出100μL溶液加入第2列中，依次进行二倍稀释，最后一列吸出100μL溶液，最后在每孔中加入100μL过夜培养稀释100倍后的菌悬液。原油、轻组分、重组分精油溶液浓度依次为6.25、3.125、1.562 5、0.781 25μL/mL，设置不加龙脑精油溶液的LB肉汤为阴性对照组，将96孔板在37℃静置培养24 h。
培养结束后倒去96孔板中的细菌悬浊液，用200μL的磷酸盐缓冲液（PBS）对每孔洗涤3次，洗去孔中的浮游菌后置于30℃烘干箱内烘干。接着对每孔加入200μL的0.01%结晶紫溶液，室温下避光染色20 min。染色结束后倒掉孔中的结晶紫溶液并将96孔板轻轻浸没于5 L装满水的烧杯中，不断重复至烧杯中的水不再变色，置于30℃烘干箱内烘干15 min。烘干孔内干燥后，每孔添加200μL 95%乙醇，使结晶紫在室温下溶解脱色15 min。每孔取出125μL洗脱液于新的透明96孔酶标板中，利用全自动微生物生长曲线分析仪测量其在570 nm处的吸光值D（570）。每个样品做3个平行。
1.4数据统计与分析
实验结果均以3组平行数据的平均值±标准差来表示。文中使用SPSS 26.0软件比较多组数据之间的差异（P<0.05认为均值之间有显著性差异），使用Origin 2021软件制图。