2.2. 来自活性污泥的细菌群落
用作受体的细菌群落从活性污泥中提取。活性污泥样品采集自中国北京市某市政污水处理厂的回流池。通过洗涤（5000 RPM离心10分钟，去除上清液，悬浮于20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中）和超声处理（100 W，30秒）从50 mL活性污泥中回收细菌群落。之后，收集混合液的上清液，经重力沉降10分钟后OD600值约为0.3-0.4，用于后续实验。
2.3. 不同重金属下的细菌抑制实验
在本研究中，使用自动生长曲线分析仪（Bioscreen C，芬兰）来估计单个金属对供体和受体细菌的半抑制浓度（IC50）。抑制实验在不含重金属的合成废水培养基（对照）或补充不同浓度的CuSO4、ZnSO4、CdCl2、Pb(NO3)2、NaH2AsO4或HgCl2中进行。将5 μL混合细菌溶液和295 μL培养基注入孔板（每孔总计300 μL），每个样品设三个重复。之后，将孔板在25°C下以中等速度培养48小时，通过自动读数器每60分钟记录一次OD600值，持续48小时。生长曲线绘制和抑制率计算与先前研究一致。
合成废水按照OECD指南（第303号，2011）配制。将0.16 g蛋白胨、0.11 g肉膏、0.03 g尿素、0.007 g NaCl、0.004 g CaCl2·2H2O、0.002 g MgSO4·7H2O和0.028 g K2HPO4溶解于1000 mL去离子水中。
2.4. 结合Bioscreen C和流式细胞术的高通量接合实验
接合实验与抑制实验类似进行，区别在于同时将受体细菌添加到孔板中（供体:受体 = 1:1）。为了定量不同条件下的质粒转移频率，使用流式细胞分析仪平台（Fortessa，BD公司，美国）在接合实验终点定量供体和接合子细胞数量。首先，将细菌悬浮液吸入2 mL离心管中。然后涡旋并用PBS溶液进一步稀释至细胞浓度约10^8个/mL，符合流式细胞术的进样标准。
供体菌株用作RFP阳性对照，活性污泥细菌用作GFP阴性对照，确定了荧光图中RFP和GFP的双门控。绿色和红色荧光分别由488 nm和561 nm激光激发。通过减去RFP阳性对照和GFP阴性对照数据中相应百分比，去除活性污泥细菌自发荧光导致的假阳性计数，Q4区中具有绿色荧光的细胞为接合子。
转移频率（F）通过接合子与供体的比值（T/D）计算如下：
T/D = NG/NR
其中NG为绿色荧光细胞数，N0为检测到的总细胞数，NR为红色荧光细胞数。通常，总共分析100,000个细菌（N0）来计算转移频率。
2.5. 微流控芯片上的接合实验和荧光成像
为了评估重金属对附着细菌之间ARG转移的影响，按照先前描述的方法组装了基于琼脂糖的微流控芯片。芯片由两个盖玻片、琼脂糖凝胶膜（约0.25 mm厚）和PDMS芯片组成。然而，四个相同的腔体而不是通道保证了充足的营养供应。供体和受体细胞首先按照抑制实验的方法处理。将5 μL混合细菌溶液滴接种在琼脂糖膜上，然后覆盖盖玻片。之后，将合成废水培养基（含或不含重金属）注入腔体中。每个接合实验持续48小时。
在接合实验结束时，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，LSM710，蔡司，德国）对芯片进行表征。使用100×/NA1.40油浸物镜拍摄高分辨率图像。由于转移事件随机出现，捕获了3个平行芯片的45个点以观察统计学上有意义的接合。所有图像使用ImageJ处理，转移频率（F）根据公式（2）计算。
F = AT/AR
其中AT和AR分别为图像中绿色接合子和受体细胞的面积。
2.6. 细胞测序和数据分析
在实验装置中显示出刺激ARG转移潜力的特定浓度重金属被进一步追踪。接合实验后，收集孔板中的每个样品，并按照2.3节中提到的方法进行处理。然后，通过荧光激活细胞分选（Aria SORP，BD公司，美国）对接合子细胞进行分选。绿色荧光由488 nm激光激发，红色荧光由561 nm激光激发。前向散射电压设置为637 V，侧向散射电压为198 V。将约20,000个表达GFP的接合子细胞分选到离心管中。然后，将样品管送至商业公司（美吉生物，北京，中国）通过高通量平台（MiSeq PE300，Illumina，美国）进行16S rRNA扩增子测序。序列分析使用美吉生物I-Sanger云平台（v2.0，www.i-sanger.com）的分析软件进行。所有样品的OTU数据首先导入平台，并根据重金属的种类分为不同组。
接合潜力（PT）反映细菌从供体宿主质粒的能力。在本研究中，根据公式（3）计算特定属的PT。选择接合子库中前25个属进行分析。系统发育树由itol（http://itol.embl.de/）构建。
PT = lg(OTU_T,i / OTU_T)
其中OTU_T,i为接合子中第i个属检测到的OTU数；OTU_T为接合子中所有属的总检测数。
使用PICRUSt根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库归一化的细菌OTU表预测微生物代谢功能。
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