摘要
越来越多的证据表明重金属可以刺激细菌之间抗生素抗性基因（ARGs）的转移。然而，以往大多数研究集中在纯菌株上，重金属对细菌群落中ARG转移的影响，特别是在活性污泥中，尚未得到明确探索。在本研究中，开发了一种结合计算机化培养箱（Bioscreen C）和流式细胞术的高通量方法，用于评估不同浓度重金属对污泥细菌群落中ARG转移的影响。通过使用大肠杆菌MG1655作为广宿主范围IncP-1质粒pKJK5的供体，发现0.5 mmol/L铅、0.1 mmol/L砷和0.005 mmol/L汞可以明显促进污泥细菌群落中的ARG转移。此外，在微流控芯片上的接合实验也证明了在上述重金属胁迫下附着群落中更高的转移频率。对铅、砷和汞胁迫下的接合子进行了分离和系统发育描述。对于砷和汞，优势属为假单胞菌，分别占88%和96%。而在铅胁迫下，气单胞菌和肠杆菌是主要接合子，分别占56%和32%。此外，与重金属运输和细胞代谢相关的ABC转运蛋白和氨基酸代谢在接合子微生物代谢功能预测中占主导地位。本研究有助于评估和控制污水处理厂中ARG的传播风险。
1. 引言
抗生素耐药性是全球性挑战，代表着对人类健康日益增长的威胁。细菌物种之间抗生素抗性基因（ARG）的转移被认为是抗生素耐药性的主要进化过程。污水处理厂（WWTPs）通常被认为是ARGs的热点区域。污水处理厂中ARGs的来源和归宿已在活性污泥工艺中得到广泛研究。由于活性污泥中细菌密度高且生物多样性丰富，ARG转移更可能在污水处理厂中发生。然而，关于活性污泥中ARG转移的研究很少。
最近，越来越多的证据表明，除抗生素外的化学污染物也可以选择并刺激抗生素耐药性，如重金属、消毒剂、纳米材料、微塑料等。在上述化学品中，重金属是污水处理厂中常见的污染物，研究已证明金属离子对ARG接合转移的影响。例如，先前研究发现，低于最低抑制浓度（MICs）的钒（III）促进了从发光杆菌到大肠杆菌的接合转移频率，而铜（II）、锌（II）和镉（II）则显示出相反的效果。同样，抑制浓度的重金属（铜、镉、镍、锌）始终降低了质粒向土壤细菌群落的转移频率。而另一项研究表明，银（I）、锌（II）和铬（VI）在环境相关和亚抑制浓度下促进了大肠杆菌菌株之间ARGs的转移。然而，这些研究主要关注特定细菌之间的ARG转移，而作为废水中ARGs的储存库和放大器的活性污泥细菌被忽视了。在亚抑制水平下，这些重金属如何影响ARGs的转移很少被研究。
目前，浮游状态下ARG转移的研究主要通过传统摇瓶进行，需要大量工作、长时间和复杂操作。难以在多种条件下同时进行接合实验。幸运的是，生长曲线分析仪（Bioscreen C）可以进行高通量实验来解决现有问题，它可以自动并行操作两个200个实验条件的孔板，为在不同条件下同时进行接合实验提供了一种新方法。另一方面，细菌在环境中不仅以浮游状态存在，还以生物膜等附着形式存在。据报道，生物膜的复杂结构和扩散阻力支持了环境中更高的水平基因转移（HGT）潜力。在生物膜中，细菌细胞对特定抗菌剂的敏感性比其浮游对应物低10到1000倍，关于重金属胁迫下附着细菌群落中ARGs转移的研究仍然非常有限。最近，一种成熟的微流控芯片被用于附着细菌的接合实验，为原位研究不同重金属下ARG转移特征的变化提供了可能。
由于活性污泥中微生物群落的多样性可能与细菌传播ARGs的概率相关，且活性污泥中存在大量机会性病原体，因此有必要了解ARGs在污水处理厂中传播到高度易感潜在物种的潜力。同时，预测微生物群落的功能具有重要意义。然而，目前尚不清楚不同重金属下接合子的群落多样性和功能。
在本研究中，结合全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C）和流式细胞术来评估六种环境相关金属（铜（II）、锌（II）、镉（II）、铅（II）、砷（V）和汞（II））对ARG转移的影响。将模型广宿主范围IncP-1ε质粒pKJK5从大肠杆菌MG1655引入活性污泥细菌群落。分析了质粒转移频率、接合子的系统发育组成和微生物代谢功能，以评估不同金属对ARG转移的影响。本研究为进一步理解重金属对污泥细菌群落中ARG转移的影响提供了依据，这对评估和控制污水处理厂中的ARGs具有重要意义。
2. 材料与方法
2.1. 供体菌株及其扩增
本研究中使用的供体菌株为携带具有甲氧苄啶抗性的pKJK5质粒的大肠杆菌MG1655，由丹麦技术大学Barth F. Smets教授赠送。供体菌株经过基因修饰，染色体上标记了编码组成型红色荧光蛋白（RFP）和lacIq产生的基因盒。目标质粒在lacIq阻遏蛋白下游标记了绿色荧光蛋白（GFP）。因此，供体细胞将产生红色荧光并抑制GFP表达。当转移事件发生时，质粒编码的GFP表达不受抑制，可以通过荧光显微镜识别绿色荧光细胞，或通过荧光激活细胞分选回收。
将大肠杆菌MG1655细胞接种于补充30 mg/L甲氧苄啶作为抗生素压力的100 mL液体LB培养基中。细菌悬浮液在37°C恒温摇床中以150 rpm的振荡速度过夜扩增，通过离心收集，在PBS溶液中洗涤（三次），收集到LB培养基中测量600 nm处的光密度（OD600）。最终稀释大肠杆菌MG1655以确保OD600值约为0.3-0.4，用于后续实验。
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