在Shewanella oneidensis的基因组中，已鉴定出一个编码周质硝酸盐还原酶（NapA）及其辅助蛋白的napDAGHB基因簇，以及一个编码周质亚硝酸盐还原酶（NrfA）的nrfA基因。这两个系统似乎是非典型的，因为基因组分别缺少编码细胞质膜电子转运蛋白的基因，即NAP系统所需的NapC和NRF系统所需的NrfBCD/NrfH。本文提供的证据表明，S.oneidensis中硝酸盐还原为铵的过程是由这些非典型系统以两步方式完成的。转录和突变分析表明，一种细胞质膜电子转运蛋白CymA，很可能在S.oneidensis中替代了NapC和NrfH两者的功能。令人惊讶的是，一个缺失编码硝酸盐还原酶小亚基napB基因的菌株，其达到最大细胞密度的时间早于野生型。对该菌株的进一步表征显示，在其培养物中未检测到游离的亚硝酸盐中间体，并且NapB为S.oneidensis在环境中竞争硝酸盐提供了适应性优势。基于对napA、napB、nrfA和napBnrfA框内缺失突变体的突变分析结果，我们提出NapB能够通过将电子专一地引导至NapA来促进硝酸盐还原。
引言
微生物的硝酸盐还原是一个复杂且被广泛研究的过程，在全球生物地球化学氮循环中扮演着主要角色。硝酸盐还原可以在细胞代谢中实现多种功能，包括为生物合成提供铵（同化还原）、为代谢产能产生质子动力（硝酸盐呼吸）以及消耗过剩的还原力（异化还原）。
周质硝酸盐还原系统（NAP）的功能是将硝酸盐还原为亚硝酸盐，此过程可与亚硝酸盐进一步还原为铵（铵化）或氮气（反硝化）相耦联。NAP已在许多革兰氏阴性菌的基因组中被识别，但其相关基因的组成和排列存在显著差异。
直到最近，人们仍认为NAP系统至少需要四个组分：NapA、B、C和D。硝酸盐还原酶（NapA）是一种含钼蛋白，是末端硝酸盐还原酶的大亚基。NapB是一种双血红素c型细胞色素，作为末端硝酸盐还原酶的小亚基，其功能是将电子传递给NapA，但本身无催化活性。这两个亚基均位于周质。NapC是NapC/NirT家族的膜锚定四血红素c型细胞色素，负责将电子从醌池通过NapB传递给NapA。NapD是一种胞质蛋白，通过结合NapA的双精氨酸信号肽参与NapA的转运。
亚硝酸盐可通过周质亚硝酸盐还原系统（NRF）进一步还原为铵（NH₄⁺），且不释放中间产物。在拥有该系统的生物中描述了两种类型的NRF：NrfAH型和NrfABCD型。虽然NrfAH型主要存在于ε-和δ-变形菌中，但NrfABCD系统在γ-变形菌中最常见。在两种类型中，亚硝酸盐还原酶（NrfA）均作为末端还原酶起作用。NrfH蛋白是一种NapC/NirT家族的四血红素c型细胞色素，负责将电子从甲基萘醌传递给NrfA，其功能等同于NrfABCD型系统中的NrfBCD。
Shewanella oneidensis MR-1是γ-变形菌门中的一种兼性厌氧菌，以其呼吸多样性而闻名。多项证据表明，通过硝酸盐逐步还原为亚硝酸盐，再还原为铵（呼吸性硝酸盐铵化）是其主导途径（即使不是唯一途径）。呼吸性硝酸盐铵化的第一步由NAP系统执行，该系统缺乏NapC；产生的亚硝酸盐在第二步中被进一步还原为铵。第二步推测由NRF系统催化，依据是存在由nrfA（SO3980）编码的周质亚硝酸盐还原酶，但缺乏NrfBCD/NrfH。然而，缺乏实验验证。有研究提出，一种属于NapC/NirT家族的c型细胞色素CymA，替代了NapC和NrfH，负责向末端还原酶转运电子。
鉴于S.oneidensis中硝酸盐和亚硝酸盐还原的这些新颖特征，更有必要全面了解该生物体内的这一过程。在本研究中，我们通过生物信息学、微阵列和突变分析系统地检查了硝酸盐和亚硝酸盐还原途径的组分。所呈现的结果确立了NRF系统负责S.oneidensis的亚硝酸盐还原，并且CymA作为NapC和NrfH的功能替代物，负责将电子转运给NapA和NrfA。出乎意料的是，NapB在S.oneidensis的硝酸盐还原中并非必需，但已被发现是来自CymA的优选电子接受蛋白。此外，竞争实验表明，NapB为生存在存在硝酸盐的环境中的该细菌提供了适应性优势。
材料与方法
本研究使用的所有细菌菌株和质粒列表见表1。大肠杆菌和S.oneidensis菌株分别在37°C和室温下在Luria-Bertani（LB,Difco）培养基中生长，用于遗传操作。需要时，抗生素按以下浓度添加：氨苄青霉素50μg ml⁻¹，卡那霉素50μg ml⁻¹，庆大霉素15μg ml⁻¹。
本研究使用两种方法进行突变体构建。使用融合PCR方法，以质粒pDS3.0为载体，对基因napA、nrfA和cymA进行框内缺失。用于生成诱变PCR产物的引物列于补充表S1。为了构建napA框内缺失突变体，分别用引物SO0848-5-F和SO0848-5-R、SO0848-3-F和SO0848-3-R扩增napA两侧的两个片段。使用扩增的片段作为模板，用引物SO0848-5-F和SO0848-3-R生成融合PCR产物，并连接到质粒pDS3.0的SacI位点，产生诱变载体（pDS-NAPA）。该载体首先导入大肠杆菌WM3064，然后通过接合导入MR-1。通过庆大霉素抗性选择诱变构建体整合到染色体中，并通过PCR确认。经验证的转接合子在无NaCl的LB肉汤中培养，并铺在补充了10%蔗糖的LB培养基上。通过PCR筛选对庆大霉素敏感且对蔗糖有抗性的菌落，以确认napA的缺失。然后通过对突变区域进行测序来验证缺失突变，缺失菌株命名为JZ0848（△napA）。
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