研究简介
本研究聚焦于同时产KPC与NDM两种碳青霉烯酶的耐药肺炎克雷伯菌（KN-CRKP），系统探讨了其临床影响、耐药机制及全球分子流行病学特征。研究采用多中心回顾性病例对照设计，并创新性地结合了体内外实验与全基因组贝叶斯进化分析。临床数据分析显示，相较于单一产KPC的CRKP感染者，KN-CRKP感染患者面临极高的死亡风险，其住院死亡率显著更高（46.2% vs 25.6%）。研究进一步明确了感染的三大独立危险因素：糖尿病、既往耐碳青霉烯类微生物（CRO）感染曾使用头孢他啶-阿维巴坦（CZA）治疗，以及近期使用过其他β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂。
药敏试验表明，该类菌株虽对碳青霉烯类和CZA完全耐药，但对全霉素（98.6%）、头孢地尔（94.4%）及氨曲南-阿维巴坦（100%）高度敏感，为临床救治提供了用药依据。在分子流行病学层面，研究发现KN-CRKP的主要流行克隆型为ST11（73.2%）和ST307（15.5%）。基于733株全球菌株的宏基因组分析显示，ST11呈现出中国与巴西分化的流行趋势，而高毒力克隆ST307在新冠大流行后持续增加。质粒谱分析揭示，blaNDM基因多由高转移性的IncX3/IncN质粒携带，而blaKPC基因则多见于IncR/IncFII质粒，且首次发现了同时携带两者的新型杂合质粒。
本研究通过患者来源样本的体外模拟及转录组测序，首次提供了直接证据：KN-CRKP可在体内外通过种间质粒转移“从头产生”（例如从弗氏柠檬酸杆菌向携带blaKPC的肺炎克雷伯菌转移blaNDM基因），且携带blaNDM的质粒具有更高的转移能力与稳定性。本研究揭示了KN-CRKP感染导致的高死亡率风险及其独特的“克隆扩张+质粒跳跃”双重传播机制。该菌株在全球范围内的持续进化，凸显了加强国际宏基因组监测与创新感染控制策略的迫切性。。
关键词：冷冻冲击巨噬细胞, 减毒沙门氏菌, 肿瘤靶向治疗, 活菌递送, 免疫激活
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
研究人员使用 Bioscreen C 微生物生长曲线分析仪来定量评估液氮冷冻冲击处理是否对胞内 VNP20009 菌株的增殖能力与生长动力学造成损伤，这是支撑整个"死细胞载体 + 活菌弹药"策略可行性的关键实验证据之一。将 VNP 菌株经两次传代充分活化，调整菌悬液 OD₆₀₀ = 1.0，取 10 μL 加入 1 mL LB 液体培养基混匀后，以 300 μL/孔 加样于 Bioscreen C 专用微孔板，在 37°C 下连续培养 30 h，仪器以 每 30 min 自动读取一次 OD₆₀₀ 的方式全程无干预地记录光密度变化，最终输出连续的细菌生长曲线。
实验结果
本研究通过系统的体内外实验证实，液氮冷冻冲击制备的LNT MACS/VNP是一种兼具高安全性与强效抗肿瘤活性的新型递送系统：在体外层面，冷冻处理彻底消除了巨噬细胞系的增殖致病性（皮下注射14天无成瘤），但未破坏细胞整体结构与表面归巢受体（CCR2/CD11b），且胞内减毒沙门氏菌VNP20009经低温冲击后仍保持近95%的存活率与正常的形态、生长动力学及感染肿瘤细胞的能力，可在模拟肿瘤微环境下延迟释放并高效增殖；在体内层面，静脉给药后LNT MACS/VNP凭借巨噬细胞的天然趋向性实现显著的肿瘤富集，肿瘤内菌载量较直接注菌组大幅提升（肿瘤:肝脏CFU比值提高约12.5倍），同时通过“隐身”伪装有效逃避中性粒细胞的清除与NETs杀伤，大幅降低全身免疫激活——肝脏炎性病灶从游离菌组的4-15处降至<2处，血清ALT/AST水平、体重下降幅度及外周血促炎因子（IL-6/IL-10）与Treg上调均被显著抑制；在抗肿瘤疗效方面，单次给药即可通过“细菌直接杀伤+免疫微环境重塑”双重机制发挥强效抑瘤作用：H22肝癌模型中肿瘤重量仅为生理盐水组的35.4%，60%小鼠生存期超过40天，瘤内M1型巨噬细胞占比提升2.79倍、M2型降低至0.3倍，CD8⁺GzmB⁺效应T细胞增加2.11倍，Treg细胞减少至对照组的42.2%，并伴随TNFα、IFNγ等效应因子的显著上调。
图1、 冷冻冲击载VNP巨噬细胞的制备与表征。a LNT巨噬细胞/VNP制备流程示意图；b 巨噬细胞(MACS)与VNP菌株共培养的明场图；Hoechst标记细胞核(蓝色)；红色箭头指示VNP菌株；比例尺=10 μm；c 共培养时间对巨噬细胞内活菌数、形态完整巨噬细胞比例的影响(n=5)；d 活巨噬细胞、活巨噬细胞/VNP、LNT巨噬细胞/VNP荧光图；FITC-鬼笔环肽标记肌动蛋白(绿色)；DAPI标记细胞核(蓝色)；红色箭头指示胞内VNP-RFP菌株；比例尺=20 μm；e 活巨噬细胞/VNP、LNT巨噬细胞/VNP明场图；Hoechst标记细胞核(蓝色)；白色箭头指示VNP-RFP菌株；比例尺=5 μm；f 扫描电镜(SEM)观察不同细胞形态；比例尺=5 μm；g LNT巨噬细胞、LNT巨噬细胞/VNP-RFP相对平均荧光强度(MFI)；a.u.为任意单位；h 活巨噬细胞、LNT巨噬细胞增殖活性对比示意图；i 活巨噬细胞、LNT巨噬细胞体内增殖活性对比(右)；数值为三次独立实验汇总；左侧为肿块解剖图；虚线椭圆为接种部位。
图2、 LNT巨噬细胞/VNP释放胞内VNP并维持活性。a活巨噬细胞/VNP、LNT巨噬细胞/VNP胞内活菌数变化(左)；右侧为平板菌落图(n=5)；b VNP液氮处理12小时后存活率(n=5)；右侧为冷冻冲击前后菌株活性示意图；c 透射电镜(TEM)观察不同细胞；红色箭头指示胞内菌株；普通视野比例尺=5 μm，放大视野比例尺=1 μm；d 活巨噬细/VNP-RFP、LNT巨噬细胞/VNP-RFP荧光强度实时监测(n=3)；e VNP-pSifB-RFP菌株胞内特异性表达示意图(左)；菌株在巨噬细胞/LB培养基中荧光图；红色为活化菌株、绿色为沙门氏菌特异性抗体、蓝色为细胞核；比例尺=5 μm；f LNT巨噬细胞/VNP-pSifB-RFP释放菌株明场图(左)；橙色箭头为胞内菌、红色箭头为胞外菌；培养基含微量庆大霉素；比例尺=20 μm；右侧为不同时间点胞外菌计数(每组随机选5视野)；
g TEM观察菌株释放(左)；白色曲线为菌株运动轨迹、橙色箭头为细胞表面缺口、蓝色箭头为胞外增殖菌；普通视野比例尺=1 μm、放大视野比例尺=500 nm；右侧为释放示意图；h 正常VNP、LNT释放VNP形态(上)及生长曲线(下)(37℃、LB培养基，n=3)；i LNT巨噬细胞/VNP与H22肿瘤细胞Transwell间接共培养示意图(3.0 μm孔径)；j 共培养后H22细胞平均荧光强度对比；k MOI=100感染1小时，H22细胞内VNP数量(n=5)；l 不同菌株感染H22细胞4小时，Annexin V/PI染色流式图(左)及凋亡率统计(右，n=4)；m M0巨噬细胞与菌株共培养6小时，M1型相关基因表达；n 不同处理后H22细胞增殖；Hoechst标记细胞核；
图3、 LNT巨噬细胞保护VNP、促进肿瘤富集。a LNT巨噬细胞/VNP伪装菌株、逃避中性粒细胞清除示意图；b 中性粒细胞与LNT巨噬细胞+VNP、LNT巨噬细胞/VNP共孵育，活菌比例变化；c、d 共孵育60分钟，培养基中中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)、活性氧(ROS)水平；e 处理1小时后外周血活化中性粒细胞(CD11b++CD62L—)比例(左流式图、右柱状图，n=5)；f 共聚焦显微镜观察活巨噬细胞、活巨噬细胞/VNP、LNT巨噬细胞/VNP表面CD11b、CCR2；白色箭头为胞内菌；比例尺=10 μm；g 不同细胞CD11b、CCR2流式图；h 不同处理后肿瘤荧光、生物发光强度(n=5；DiR标记细胞、VNP-LuxCDABE菌株)；i 处理8小时后离体肿瘤荧光图；j 注射后肿瘤内菌数时间曲线(n=4/5)；k 第6天肿瘤/肝脏菌数比值。
图4 、LNT 巨噬细胞/VNP降低菌株毒性。a H22荷瘤小鼠安全性、肿瘤靶向、治疗实验分组示意图(G0–G4)；b给药1天后各组肝脏炎症灶；黑色箭头为病灶；比例尺=10 mm；c各组肝脏病灶数对比(n=5)；d肝脏H&E染色(给药1天)；黑色箭头为肝损伤；比例尺=40 μm；e随机视野肝损伤面积统计；f给药1天血清ALT、AST水平(n=4/5)；g给药1天体重变化(n=9)；h细菌刺激免疫细胞分泌炎症因子示意图；i给药1天外周血IL-6、IL-10浓度(n=5)；j给药1天外周血Treg(CD25+CD127-)比例；左流式图、右柱状图(n=5)；k心、肾、肺、脾H&E染色；比例尺=40μm；
图5、 LNT 巨噬细胞/VNP有效抑制H22肿瘤生长。a H22荷瘤小鼠安全性、肿瘤靶向、治疗实验分组示意图；b 不同处理后肿瘤生长曲线(n=7)；c 各组单只小鼠肿瘤生长曲线；d、e 给药12天肿瘤照片、重量；比例尺=10 mm；f 各组肿瘤体积倍增时间对比；g 肿瘤H&E染色；黑色箭头为坏死区；比例尺=100 μm；随机5视野坏死面积统计；h 小鼠生存曲线；数据为均值±标准差。
总结
活菌介导的抗肿瘤疗法是肿瘤免疫治疗领域的重要里程碑。然而，细菌疗法难以兼顾安全性与有效性，限制了其临床应用。在维持生物安全性的同时，提高细菌的肿瘤靶向递送效率，是活菌肿瘤治疗临床转化的关键难题。本研究利用液氮对负载减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的巨噬细胞系进行冷冻冲击处理，制备出“死亡”但“具有功能”的载沙门氏菌巨噬细胞。所得“死亡”巨噬细胞平均每100个细胞可负载约257个活菌。
工程化细胞保留完整细胞结构、丧失原有致病性，而胞内细菌维持原始生物活性并延迟释放、增殖。这种“特洛伊木马”式细菌伪装策略，可避免细菌免疫原性引发的外周血中性粒细胞募集与激活，减少中性粒细胞对细菌的清除，显著提升全身给药后细菌在肿瘤内的富集效率。此外该策略可强烈激活肿瘤微环境：增加抗肿瘤效应细胞(包括M1型巨噬细胞、CD8+效应T细胞)、减少促肿瘤效应细胞(包括M2型巨噬细胞、CD4+调节性T细胞)，最终在皮下H22荷瘤小鼠模型中提升抗肿瘤疗效。冷冻冲击巨噬细胞介导的细菌递送策略，有望拓展活菌在肿瘤治疗中的应用。
该研究成功构建了“死细胞载体-活菌弹药”的创新范式，既解决了原代巨噬细胞扩培困难、活载体致病风险的难题，又突破了传统活菌疗法“安全-疗效”难以平衡的瓶颈，为细菌介导的肿瘤免疫治疗提供了可标准化制备、稳定储存的临床转化新路径。Bioscreen全自动生长曲线分析仪具有高通量、自动化、连续监测的方式替代了人工间断取样测 OD 的低效率与操作误差，能在同一实验批次内完成多组平行重复（n=3）的长时间动态追踪，所得生长曲线直接表明 Released-VNP 与 Normal-VNP 在迟滞期、对数期增速及最终平台期 OD 值上均无显著差异，从而为"液氮冷冲击杀灭巨噬细胞的同时，胞内沙门氏菌的活力与增殖潜能基本完好保留"提供了客观的定量支撑——这一结论是后续所有关于细菌延迟释放、瘤内定植扩增及抗肿瘤功效论证的生长功能基础。
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