研究简介
本研究开发并优化了一种基于浊度测量的高通量方法，用于丝状真菌的生态生理学研究和抗真菌化合物的快速筛选。传统上，针对丝状真菌（如产毒真菌）的生态生理学研究或防腐剂效能评估多依赖于琼脂平板系统，通过测量菌落径向生长速率来计算半致死剂量（LD50/LD90）。这种方法不仅耗时、需要大量重复平板，且其测量基于一维的菌丝延伸，无法准确反映三维空间内的真实生物量增长，在评估多因素交互作用时尤为不便。研究人员对 Bioscreen C 微生物生长曲线分析仪的应用进行优化，使其适用于长周期（可达7天）的丝状真菌生长监测。研究团队以黄曲霉（Aspergillus flavus）为模型菌株，系统优化了关键实验参数。研究发现，使用特定浓度的半固体酵母提取物蔗糖培养基（含0.125%琼脂）能有效将孢子悬浮在三维空间中，促进菌丝网络均匀生长，从而获得稳定、可重复的浊度-时间生长曲线。此外研究确定了最佳接种量（10^5孢子/毫升）和培养基体积（200-400微升），并验证了光密度值与真菌生物量之间存在直接线性关系，确保了浊度测量结果的可靠性。
研究人员评估了丙基丙烷硫代亚磺酸盐（PTS）在四种不同环境条件（温度：20°C与25°C；水分活度：0.995与0.95）下对黄曲霉的抑制效果。结果表明，尽管环境因素影响了真菌的基础生长速率（体现在模型参数P0的差异上），但PTS的抑制效能（模型参数P1和P2）在不同环境条件下无显著差异，证明了该化合物效力的稳定性。
同时，研究发现在评估中度胁迫条件时，基于生物量测量的MIC50值（32-34 ppm）略低于基于菌落延伸速率计算的LD50值（40-45 ppm），提示基于生物量的评估可能更为敏感和准确。本研究成功建立了一种快速、高效、可自动化的方法，能够精确量化环境因素和抗真菌化合物对丝状真菌生长的交互影响。该方法显著减少了实验时间、人力和物料消耗，为食品保鲜领域的防腐剂筛选、真菌预测微生物学模型构建以及制定有效的“栅栏”防腐策略提供了强大的新工具。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
应用全自动生长曲线分析仪Bioscreen测试了丝状真菌黄曲霉素中加入不同浓度的丙基丙烷硫代磺酸盐(PTS)后对应的生长曲线图（OD600），对比了丝状真菌在不同不同环境下的生长情况，并计算了它们在不同条件下的对应的O600值上的差异。测试的生长曲线的周期为7天，每隔20分钟测试一次 OD600值，培养过程中各菌株的摇晃、生长及OD值的测试全是自动完成的，从而筛选获得抗真菌化合物PTS对丝状真菌黄曲霉素的最低抑制浓度MIC和非抑制浓度(NIC)值。
实验结果
应用全自动生长曲线分析仪Bioscreen测试了丝状真菌黄曲霉素中加入不同浓度的丙基丙烷硫代磺酸盐(PTS)后对应的生长曲线图（OD600），对比了丝状真菌在不同不同环境下的生长情况，并计算了它们在不同条件下的对应的O600值上的差异。测试的生长曲线的周期为7天，每隔20分钟测试一次 OD600值，培养过程中各菌株的摇晃、生长及OD值的测试全是自动完成的，从而筛选获得抗真菌化合物PTS对丝状真菌黄曲霉素的最低抑制浓度MIC和非抑制浓度(NIC)值。
图 1、— 在YES培养基中获得的生长曲线：（A）含0.2%琼脂，(B)含0.125%琼脂，接种105 spores/mL黄曲霉（25°C）。包括10个未接种对照孔的重复实验。
图2、— 接种不同初始孢子浓度（10^2–10^6 spores/mL）于含0.125%琼脂的YES培养基（25°C）后获得的平均生长曲线（十个个体曲线）。包括10个未接种对照孔的重复实验。
图 3、 在两个不同初始孢子浓度实验中，不同孵育时间下黄曲霉的平均生物量与O.D.的关系。孵育温度为20°C。
图4、在Bioscreen C微量孔板中加载不同体积培养基后获得的平均生长曲线（十个个体曲线）。接种浓度为105 spores/mL，孵育温度为25°C。
图 5、八种PTS浓度下的平均生长曲线（五个个体曲线），显示在YES培养基中含0.125%琼脂、接种105 spores/mL黄曲霉后的生长情况：（A）25°C, aw 0.995；（B）25°C, aw 0.95；（C）20°C, aw 0.995；（D）20°C, aw 0.95。实验持续7天，显示代表性浓度的PTS效果。
总结
本论文主要开发了一种快速筛选抗真菌化合物，并进行生态生理学研究的高通量方法，利用特殊的半固态培养基对丝状真菌进行了研究，采用分光光度/浊度法测量，所使用的仪器设备是Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，该仪器结合2块100孔的微孔板可同时平行测试多个各种菌株样品的生长曲线，并且所有的过程都是自动化的。本论文的研究人员全面研究了培养基的组成和制备，接种剂的大小，培养基体积和孵育参数等用于测量初始真菌的萌发和生长动态的优化，全自动生长曲线分析仪Bioscreen C在本研究工作中主要是用于评估18种浓度的丙基丙烷硫代磺酸盐(PTS) 在不同的环境下对黄曲霉的抑制作用。
研究过程采用了一种以前用于细菌抑制的数学模型方法，即超过7天的自动化周期培养，每20分钟测量一次，很好的获得相关的最低抑制浓度(MIC)，并计算了非抑制浓度(NIC)值。从以上研究可以看出应用全自动生长曲线分析仪Bioscreen分析仪建立的这种筛选抗真菌类的方法对于快速筛选生长和丝状生物次生代谢产物的产生和利用具有非常好的应用前景，尤其是该设备能够缩短测试时间，研究所需培养基体积量少，这也说明全自动生长曲线分析仪Bioscreen不仅可用于研究腐败菌和致病菌，还可用于丝状真菌病原体的生态生理学和抗真菌筛选,为相关微生物领域的研究人员在筛选各类微生物提供了重要的技术支持。
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