图2 、FadA增强分枝杆菌在肉芽肿中的存活。a野生型、ΔFadA或ΔFadA+FadA海分枝杆菌菌株的细胞裂解液和培养滤液的免疫印迹，使用抗FadA、抗ESAT-6和抗SigA抗体(稀释比例1:1000)。条形代表条带强度的光密度分析。结果代表三个独立实验。b野生型、ΔFadA或ΔFadA+FadA海分枝杆菌菌株在30℃有氧或缺氧条件下体外生长10天的生长曲线。c-f成年斑马鱼腹腔注射感染约200 CFU/尾的野生型、ΔFadA或ΔFadA+FadA海分枝杆菌菌株1天或14天。通过全鱼切片评估组织病理学，包括细菌滴度(c均值±SEM，感染1天(n =3条鱼，感染14天n=5条鱼)，对感染野生型、ΔFadA或ΔFadA+FadA海分枝杆菌的成年斑马鱼肉芽肿进行比较，按海分枝杆菌载量(少于10个菌或10个及以上菌)评分(d)，或每条鱼中坏死性肉芽肿的百分比(e)，以及感染14天斑马鱼的H&E或抗酸染色(f，比例尺，100μm(上)和20μm(下))。d, e中的"n"是每种菌株感染鱼的总肉芽肿数。分析的斑马鱼总数为五条(野生型)、五条(ΔFadA)、五条(ΔFadA+FadA)。b-f中的数据代表一次实验，至少有三个独立重复。使用单因素方差分析加Bonferroni多重比较检验(c)和Fisher精确检验(d, e)进行统计分析。
图3 、FadA抑制宿主免疫反应。a用H37Rv、H37RvΔFadA或H37Rv(ΔFadA+FadA)株感染4小时(MOI=1)的腹膜巨噬细胞中Il6 mRNA的qPCR分析(均值±SEM)。b腹腔注射感染约200 CFU/尾的野生型、ΔFadA或ΔFadA+FadA海分枝杆菌菌株14天的成年斑马鱼中Il6 mRNA的qPCR分析(均值±SEM，n=5)。cil6+/+和il6−/−斑马鱼中Il6 mRNA的qPCR分析(均值±SEM)。采用Cas9/gRNA系统生成IL-6敲除斑马鱼，如前所述在中国斑马鱼资源中心构建。
d–gil6+/+和il6−/−突变成年斑马鱼腹腔注射感染约200 CFU的野生型、ΔFadA或ΔFadA+FadA海分枝杆菌菌株14天。评估细菌滴度(d；均值±SEM，感染14天n=5条鱼)、组织病理学(e；代表一次实验，至少有三个独立重复；比例尺，100μm(上)和20μm(下))，并对感染野生型、ΔFadA或ΔFadA+FadA海分枝杆菌的il6+/+和il6−/−成年斑马鱼肉芽肿进行比较，按海分枝杆菌载量(少于10个菌或10个及以上菌)评分(f)或每条鱼中坏死性肉芽肿的百分比(g)如前所述进行评估。
"n"是每种菌株感染鱼的总肉芽肿数。分析的斑马鱼总数：五条(WT/il6+/+)、五条(ΔFadA/il6+/+)、五条(ΔFadA+FadA/il6+/+)、五条(WT/il6−/−)、五条(ΔFadA/il6−/−)、五条(ΔFadA+FadA/il6−/−)。a–g中的数据代表一次实验，至少有三个独立重复。使用单因素方差分析加Bonferroni多重比较检验(a, b, d)、双尾非配对Student's t检验(c)和Fisher精确检验(f, g)进行统计分析。
图4 、FadA通过H3K9Ac抑制IL-6。a从对照组或组蛋白去乙酰化酶1–3抑制剂CI-994预处理的腹膜巨噬细胞，用H37Rv、H37RvΔFadA或H37Rv(ΔFadA+FadA)株感染4小时(MOI=1)后，Il6 mRNA的qPCR分析(均值±SEM)。b从对照组或OSS_128167(一种选择性增加H3K9乙酰化的抑制剂)预处理的腹膜巨噬细胞，用H37Rv、H37RvΔFadA或H37Rv(ΔFadA+FadA)株感染4小时(MOI=1)后，Il6 mRNA的qPCR分析(均值±SEM)。
c用H37Rv或H37RvΔFadA株感染4小时(MOI=1)的腹膜巨噬细胞中，使用SimpleChIP酶促染色质免疫沉淀试剂盒对Il6启动子进行组蛋白H3赖氨酸9残基乙酰化的ChIP-seq分析。d对用阴性对照、H37Rv、H37RvΔFadA或H37Rv(ΔFadA+FadA)株感染4小时(MOI=1)的腹膜巨噬细胞中Il6启动子的H3K9Ac进行ChIP-qPCR(均值±SEM)分析。a, b, d中的数据代表一次实验，至少有三个独立重复。使用单因素(d)或双因素(a, b)方差分析加Bonferroni多重比较检验进行统计分析。
图5、FadA减少乙酰辅酶A。a) FadA乙酰辅酶A乙酰转移酶活性示意图。b)重组FadA蛋白乙酰转移酶活性的体外双底物稳态动力学测定。c)用H37Rv、H37RvΔFadA或H37Rv(ΔFadA+ FadA)菌株感染4小时(MOI=1)的腹膜巨噬细胞中乙酰辅酶A水平的测定(均值±SEM)。d)用H37Rv或H37Ra感染4小时(MOI=1)的腹膜巨噬细胞中乙酰辅酶A水平的测定(均值±SEM)。e)用重组ESAT-6蛋白(5μg/mL)刺激4小时的腹膜巨噬细胞中乙酰辅酶A水平的测定(均值±SEM)。
f)从对照组或ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂BMS-303141预处理的腹膜巨噬细胞，用H37Rv、H37RvΔFadA或H37Rv(ΔFadA+FadA)菌株感染4小时(MOI=1)后，Il6 mRNA的qPCR分析(均值±SEM)。b–f中的数据代表一次实验，至少有三个独立的生物学重复；每个圆圈代表一个技术重复。使用单因素(c, d)或双因素(f)方差分析加Bonferroni多重比较检验以及双尾非配对Student's t检验(e)进行统计分析
总结
致病性分枝杆菌在潜伏性结核感染期间会诱导形成缺氧肉芽肿，在此过程中，免疫系统能够控制但无法清除分枝杆菌。脂肪酸代谢相关基因在分枝杆菌基因组中相对富集，并且分枝杆菌倾向于利用宿主来源的脂肪酸作为营养来源。然而，分枝杆菌是否以及如何调控宿主脂肪酸代谢以驱动肉芽肿进展尚不清楚。本文中，我们报道了缺氧条件下的分枝杆菌显著分泌蛋白Rv0859/MMAR_4677(脂肪酸降解A，FadA)，该蛋白在结核性肉芽肿中也富集。FadA作为乙酰转移酶，将宿主乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A。降低的乙酰辅酶A水平抑制了宿主促炎细胞因子Il6的H3K9Ac介导的表达，从而促进肉芽肿进展。
此外，补充乙酸盐可增加乙酰辅酶A的水平并抑制肉芽肿的形成。本研究发现揭示了一种缺氧诱导的分枝杆菌蛋白通过调控宿主脂肪酸代谢来抑制宿主免疫的意外机制，并为结核感染的新型治疗策略提供了可能性。Bioscreen在本研究中充当了一个自动化、高通量的细菌生长监测平台。它的核心作用是提供客观、定量的数据，以排除生长速率这一混淆因素。通过证明野生型、FadA敲除突变体（△FadA）及回补株（△FadA+FadA）在好氧和缺氧条件下的生长曲线均无显著差异。
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