摘要
背景：除了高效利用戊糖外，高抑制剂耐受性是任何用于木质纤维素生物质经济可行的工业生物乙醇生产的生物体所需的关键性状。尽管最近的工作已成功在强健的工业酿酒酵母菌株中建立有效的木糖发酵，但所得菌株仍缺乏足够的抑制剂耐受性，无法在木质纤维素水解物中高效发酵糖。本工作的目的是将高木糖发酵活性和高抑制剂耐受性结合到单一工业酵母菌株中。
结果：我们使用未脱毒的酸预处理云杉水解物筛选了580个酵母菌株的抑制剂耐受性，并确定了一种三倍体工业面包酵母菌株具有最高的抑制剂耐受性。从该菌株中，获得了一个具有更高抑制剂耐受性的有交配能力的二倍体分离株。将其与最近开发的D-木糖发酵二倍体工业菌株GS1.11-26（具有Ethanol Red遗传背景）杂交。从四倍体杂交后代中筛选819个二倍体分离株，产生了两个菌株GSF335和GSF767，结合了高抑制剂耐受性和高效木糖发酵。在平行方法中，GS1.11-26与Ethanol Red的单倍体分离株的减数分裂重组以及104个分离株的筛选产生了类似的抑制剂耐受性二倍体菌株GSE16。三个优良菌株在云杉水解物中对抑制剂的耐受性显著提高，葡萄糖消耗速率更高，有氧生长速率更高，以及在超高浓度发酵中具有更高的最大乙醇积累能力，与GS1.11-26相比。在复合培养基中，三个优良菌株的D-木糖利用速率为0.36至0.67克/克干重/小时，低于GS1.11-26（1.10克/克干重/小时）。另一方面，在未脱毒的酸预处理云杉水解物的分批发酵中，三个优良菌株显示出与GS1.11-26相当的D-木糖利用速率，这可能是因为它们具有更高的抑制剂耐受性。与Ethanol Red相比，它们产生的乙醇多23%。
结论：我们成功构建了三个优良的工业酿酒酵母菌株，将高效的D-木糖利用与高抑制剂耐受性相结合。由于背景菌株Ethanol Red在工业应用中有成功的记录，三个新的优良菌株在工业生物乙醇生产中具有很强的直接应用潜力。
背景
由非食品木质纤维素生物质（如农业和林业残留物、城市固体废物和能源作物）生产的生物燃料被认为是未来交通能源短缺和温室气体排放问题的重要可持续解决方案。此类木质纤维素材料构成了生物圈中最丰富的有机材料，因此代表了运输能源的巨大且可再生的储备。尽管在过去三十年中已实现了利用这一潜力的重要技术进步，但所谓的第二代生物燃料生产尚未以经济可行的方式实现。
生物乙醇目前是用作交通运输领域的主要可再生生物燃料。它已在巴西、美国以及越来越多的欧洲国家大规模引入，现在主要从粮食作物中生产。在过去几年中，大量努力集中在从非食品木质纤维素生物质生产生物乙醇。从木质纤维素废物（如作物残留物和甘蔗渣）以及生物能源作物的种植中生产生物乙醇，有可能在替代交通运输用化石燃料方面做出重大贡献。
先进生物乙醇生产的主要挑战是开发高效廉价的技术，以从木质纤维素原料中释放所有可发酵糖，以及工程化强健的微生物，能够快速发酵生物质水解物中存在的所有糖，主要是葡萄糖和D-木糖。已报道了多种预处理和酶水解工艺，其释放生物质中糖的效率不断提高。甚至已开发出分泌纤维素酶的酵母菌株用于整合生物加工。然而，除了释放可发酵糖外，在预处理过程中还释放了大量几种类型的抑制性化合物。它们抑制微生物发酵和生长，导致乙醇产量和生产力严重降低。因此，经济上可行的木质纤维素衍生物乙醇工业生产不仅需要能够发酵木质纤维素水解物中所有己糖和戊糖单糖的微生物，还需要对木质纤维素水解物中存在的有毒化合物表现出异常高耐受性的微生物。
过去几年在开发能够发酵D-木糖的酵母菌株以及获得具有改善抑制剂耐受性的菌株方面取得了实质性进展。一些具有改善抑制剂耐受性的D-木糖发酵重组酿酒酵母菌株和天然D-木糖利用酵母物种也有报道。然而，这项工作大多数是用实验室酿酒酵母菌株或没有工业生物乙醇生产成功记录的酿酒酵母和其他酵母物种菌株进行的。此外，就D-木糖发酵和抑制剂耐受性而言，现有最佳菌株的性能仍需要很大改进，以达到木质纤维素水解物的高效发酵，特别是在较高固体负荷下。由于戊糖发酵对有毒抑制剂更为敏感，酵母在高密度木质纤维素水解物中的生产力在很大程度上取决于戊糖发酵的稳健性。
最近，从Ethanol Red（一种用于第一代生物乙醇生产的优质工业酵母菌株，以玉米和小麦为原料）开发了D-木糖发酵菌株GS1.11-26。Ethanol Red在发酵能力和产量、高稳健性和胁迫耐受性、糖蜜补料分批生产的优异性能、脱水耐受性以及储存和运输期间维持高活力方面有良好的记录。因此，菌株GS1.11-26被认为在开发用于各种木质纤维素材料高效发酵的全能强健酵母菌株方面具有非常有前景的潜力。然而，由于在用于开发该菌株的诱变和/或进化工程过程中积累的背景突变，GS1.11-26没有保留对高浓度乙醇和乙酸盐的相同耐受性，并且在超高浓度发酵中显示出与原始Ethanol Red菌株相比降低的乙醇积累能力。此外，它还有部分呼吸缺陷导致有氧生长速率降低，这将损害酵母在大规模补料分批模式下的繁殖。因此，该菌株本身不适合直接工业应用。
我们现在报告从GS1.11-26菌株衍生的三种新的木糖利用工业酵母菌株的开发，它们缺乏其负面特性。新菌株是二倍体，通过与强抑制剂耐受性三倍体菌株的二倍体分离株以及Ethanol Red的单倍体分离株进行减数分裂重组获得。第一个菌株是通过筛选大量酵母菌株对未脱毒酸预处理云杉水解物的耐受性而确定的最具抑制剂耐受性的菌株。三种新的优良菌株表现出对各种抑制剂在云杉水解物中的耐受性显著增加，在葡萄糖培养基中生长速率更快，葡萄糖消耗速率更快，以及在超高浓度发酵中具有更高的乙醇积累能力。三种新菌株的最大D-木糖利用速率比GS1.11-26慢，但它们在大约32小时内完全消耗了37克/升D-木糖和36克/升葡萄糖。我们的结果还表明，二倍体工业酵母菌株中存在的商业重要性状可以组合成具有优良特性和性能的单一工业酵母菌株，而无需分离单倍体菌株。
方法
酵母菌株和培养基
表1 本研究中使用的酵母菌株，包括在云杉水解物中抑制剂耐受性最高的14个选定菌株
| 名称 | 来源 | 来源/参考文献 |
|---|---|---|
| JT21585 | 面包酵母 | Puratos，比利时 |
| JT21586 | 面包酵母 | Puratos，比利时 |
| JT21587 | 面包酵母 | Puratos，比利时 |
| JT21621 | 面包酵母 | Anchor Yeast，南非 |
| JT21651 | 面包酵母 | Algist Bruggeman，比利时 |
| JT21652 | 面包酵母 | Algist Bruggeman，比利时 |
| JT21653 | 面包酵母 | AB Mauri，澳大利亚 |
| JT21698 | 蒸馏酵母 | Lallemand，加拿大 |
| JT22194 | 啤酒生产酵母 | Kasteel triple beer，比利时 |
| JT22231 | 葡萄酒酵母 | LALVIN（Lallemand，加拿大） |
| JT22272 | 苹果醋天然分离株 | 天然分离株，斯洛文尼亚 |
| JT22280 | 苹果醋天然分离株 | 天然分离株，斯洛文尼亚 |
| JT22728 | 面包酵母 | PYCC-葡萄牙酵母培养物保藏中心，葡萄牙 |
| FY290 | 水果天然分离株 | BCCM/MUCL（鲁汶天主教大学真菌库；比利时） |
| Ethanol Red | 生物乙醇生产酵母 | Fermentis，S. I. Lesaffre部门，法国 |
| HDY.GUF5 | Ethanol Red背景，携带D-木糖和L-阿拉伯糖代谢基因盒 | 文献 |
| GS1.11-26 | HDY.GUF5背景，为D-木糖发酵进化 | 文献 |
| Fseg25 | JT21653的分离株 | 本研究 |
| ER17 | Ethanol Red的分离株 | 本研究 |
| GSF335 | GS1.11-26和Fseg25的杂交菌株 | 本研究 |
| GSF767 | GS1.11-26和Fseg25的杂交菌株 | 本研究 |
| GSE16 | GS1.11-26和ER17的杂交菌株 | 本研究 |
本研究中使用的酵母菌株列于表1。酵母细胞在酵母提取物蛋白胨（YP）培养基（10克/升酵母提取物，20克/升细菌学蛋白胨）中繁殖，补充20克/升D-木糖（酵母提取物蛋白胨D-木糖）或20克/升葡萄糖（酵母提取物蛋白胨葡萄糖）。制备固体平板时，在用4M KOH将pH调节至6.5后添加15克/升Bacto琼脂。发酵和生长测试的接种物通过在酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基中培养菌株至稳定期制备，在4°C下以2100克离心5分钟收获，并用冰冷的灭菌Milli-Q水洗涤。
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