摘要：
PknB是分枝杆菌细胞分裂和细胞壁生物合成所必需的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本文证明，在分枝杆菌中过表达外部PknB_PASTA结构域会导致延迟再生长、细菌伸长积累以及对β-内酰胺类抗生素的敏感性增加。蛋白质组学研究揭示，这些变化伴随着某些参与细胞壁生物合成的酶的产生改变。由过表达PknB_PASTA结构域引起的生长抑制可被提高的镁离子浓度完全消除，但胞壁肽则不能。最后，我们发现添加重组PASTA结构域可以阻止结核分枝杆菌的再生长，因此为控制该病原体的复制提供了另一种机会。这些结果表明，PknB_PASTA结构域参与调节肽聚糖的生物合成和维持细胞壁结构。
1. 引言
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶广泛分布于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中。结核分枝杆菌是结核病的病原体，拥有11个STPK，其中PknA和PknB在实验室培养中是生长不可或缺的，而PknE、PknG和PknH则与结核分枝杆菌的毒力有关。必需的PknB激酶属于仅在革兰氏阳性细菌中发现的一个独特STPK家族。这些激酶的一个重要特征是在表面暴露区域存在所谓的PASTA结构域。在厚壁菌门中，含有PASTA结构域的激酶对生长并非必需。
在金黄色葡萄球菌中，Stk1突变体毒力受损，并且对Triton X-100和磷霉素具有更高的抗性，而在肺炎链球菌中，StkP激酶对感受态、生物膜形成和毒力很重要。对肺炎链球菌中StkP作用的更详细研究表明，它在协调生长期间的细胞分裂和肽聚糖合成中起着关键作用。相比之下，枯草芽孢杆菌中的PrkC被证明对稳定期的存活很重要。然而，在后来的研究中表明，PrkC调节了一条新的胞壁肽介导的萌发途径，并可能通过控制Yoch裂解酶的表达来调节细胞壁的重塑。
在天蓝色链霉菌中，含有PASTA结构域的激酶PknB调节碳通量和抗生素生产，并且对生长不是必需的。在谷氨酸棒杆菌中，PknB对生长也是可有可无的，只有当缺失多个STPKs的突变体中才能检测到复制和细胞形状的显著变化。在这种细菌中，PknB显然调节FtsZ的聚合；然而，这一观察结果的确切机制和生物学意义需要进一步研究。
分枝杆菌似乎是一个独特的细菌类群，其中PknB对生长是必需的。在耻垢分枝杆菌和卡介苗中，其过表达或部分耗竭会引起细胞形态的剧烈改变和生长抑制；PknB的酶活性被证明是观察到效应所必需的。在过去的十年中，在识别PknB底物方面取得了巨大进展。它们包括来自不同功能类别的蛋白质：细胞壁酶、调节蛋白以及参与细胞分裂的蛋白质。此外，PknB调节一个“氧介导的复制开关”，从而调节向休眠状态的转换和复苏。因此，PknB被认为是开发抗结核抗菌药物的关键药物靶点也就不足为奇了。已经研究了PknB激酶抑制剂用于杀灭结核分枝杆菌的可能应用。然而，仅取得了有限的成功，主要是因为这些药物对分枝杆菌细胞的渗透性差。
图1. 本研究中构建的PknB蛋白结构及菌株示意图。激酶结构域：N端激酶结构域（氨基酸1-279）；跨膜区（TM）：跨膜区域（氨基酸331-354）；TM-pasta结构域：青霉素及丝氨酸/苏氨酸激酶相关结构域（氨基酸331-627）；MYC-HIS标签：组氨酸标签；pasta结构域（氨基酸354-627）。
PknB由几个结构域组成；其中一些的功能已被确定，而其他结构域的确切作用仍然未知。PknB的组成部分包括一个保守的催化激酶结构域、一个与跨膜区域相连的近膜部分以及由PASTA组成的表面暴露的传感组件，称为PknB_PASTA结构域。PASTA结构域被认为能够识别新生肽聚糖的生长链并激活STPKs。结构研究表明，枯草芽孢杆菌的PASTA结构域以相对较高的亲和力结合合成的胞壁肽，其中胞壁肽中二氨基庚二酸的存在对这种结合至关重要。来自分枝杆菌的PknB_PASTA结构域也能结合合成的胞壁肽；然而，这种结合是否影响PknB的激活、细菌生长和复苏仍不清楚。
在这项研究中，我们研究了细胞外PknB_PASTA结构域本身是否在分枝杆菌生长中发挥独特作用，因此可以潜在地用作药物靶点或新的化疗剂。本文呈现的结果表明，PASTA结构域可能识别生长的肽聚糖链，并调节青霉素结合蛋白的产生以及参与分裂和隔膜生成的蛋白质的分布。此外，我们的数据表明，PknB_PASTA结构域与细胞壁的相互作用很重要，并且其丰度可能作为控制细胞壁完整性和细菌生长的机制。
2. 材料与方法
2.1. 细菌菌株和生长培养基
耻垢分枝杆菌mc2155、卡介苗Glaxo菌株和结核分枝杆菌H37Rv在Sauton培养基或补充了白蛋白-葡萄糖复合物的Middlebrook 7H9培养基中生长。耻垢分枝杆菌也在添加了0.05%吐温80以防止细菌聚集的LB培养基中生长。所有细菌菌株在BD Falcon锥形管或锥形瓶中于37°C摇动培养。需要时，抗生素以下列浓度添加。
通过测量在Jenway分光光度计中580 nm处的吸光度来追踪细菌生长。使用Bioscreen全自动生长曲线分析仪在各种培养基中培养耻垢分枝杆菌。通过评估在7H10琼脂上的菌落形成单位来测定存活力。上清液来自在Sauton培养基中生长的对数期结核分枝杆菌培养物，经过两次过滤除菌并立即用于实验。对于剂量依赖性实验，培养上清液冷冻干燥并重悬于无菌水中。对于低镁对照实验，Sauton培养基中MgSO4的浓度为0.2 mM。
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