材料和方法
细菌和噬菌体
使用胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）、胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）和胰蛋白酶软琼脂（TSB + 0.4% 琼脂）（Difco Laboratories, Detroit, MI）来培养宿主细菌和繁殖噬菌体。本研究中使用的细菌菌株是鲍氏志贺氏菌 C865-2（加拿大圭尔夫大学食品安全研究所（CRIFS），加拿大安大略省），用于噬菌体繁殖。其他细菌菌株列于表 1，来自 CRIFS 收藏（前缀为“C”的菌株）或 Nancy Strockbine（美国佐治亚州亚特兰大疾病控制与预防中心国家传染病中心细菌和真菌病部门）。
噬菌体的富集、分离和繁殖
从当地污水处理厂（加拿大安大略省圭尔夫）收集的污水样本与等体积的 TSB 和 100μL 选定的志贺氏菌菌株混合的过夜培养物一起富集。混合物在 30°C 下温和摇动培养 16-20 小时。孵育后，悬浮液在 4°C 下以 4000 x g 离心 15 分钟（Beckman Avanti J-20 XPI, Beckman Coulter Inc., Mississauga, ON, Canada）。将上清液小心转移到另一个管中，并通过 0.45 um 孔径的无菌一次性过滤器（Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada）过滤，并存储在 4°C。
通过点样试验检测富集物中的噬菌体。简而言之，将 100μL 细菌过夜培养物加入 50-55°C 熔化的含有 0.4% 琼脂糖的 4 mL TSB 中，混合后倒入 TSA（1.5% 琼脂）平板，固化 15 分钟。将过滤样品的 10 uL 点样到顶层软琼脂上，干燥 20 分钟，然后在 25°C 下孵育 16-20 小时。
孵育后，检查平板是否存在完全或部分裂解区；使用无菌接种环从 TSA 平板上切下这些区域，并分别放入 1 mL 的 λ-Ca2+ 噬菌体缓冲液（λ 缓冲液：2.5 g/L MgSO4·7H2O；0.05 g/L 明胶；6 mL/L 1 M Tris 缓冲液；pH 7.2）中。在 121°C 高压灭菌 15 分钟后，将过滤除菌的 CaCl2·2H2O 加入 λ 缓冲液至终浓度 5 mM。将管在室温下放置过夜，让噬菌体从软琼脂中扩散出来。然后将混合物通过 0.45μm 膜过滤器（Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada）过滤以纯化噬菌体。如先前所述，通过挑选单个噬菌斑并使用软琼脂覆盖法纯化分离的噬菌体。该过程重复 3 次以获得纯化的噬菌体。
使用 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪确定宿主范围
使用 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪（Labsystems, Helsinki, Finland）通过测量测试细菌在噬菌体存在下的光密度（OD）来确定 AG3 对 29 种志贺氏菌菌株的宿主范围。所有实验使用以下实验参数：单次，宽波段（wb）波长；25°C 孵育温度；5 分钟预热时间；动力学测量；测量时间 24 小时；每 20 分钟读取一次，每次测量前中等强度摇动 10 秒。将五十微升噬菌体裂解液转移到 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪（Growth Curves USA, New Jersey, USA）的灭菌蜂窝板的 100 个孔中的每一个，每个孔接种 125μL 稀释的测试细菌过夜培养物（约 10^8 CFU/mL）。感染复数（MOI）约为 100。对照孔包含仅噬菌体、仅噬菌体缓冲液或等体积噬菌体缓冲液与细菌。所有样品进行三次重复测试。使用 Bioscreen C 数据处理软件版本 5.26（Labsystems, Helsinki, Finland）分析 OD 数据以确定检测时间（每个测试孔增加 0.3 OD 单位所需的时间）。将检测时间（时:分）转换为十进制值，取平均值，并从每个测试分离株的所有测试数据中减去平均对照检测时间，表示为检测时间差（DT diff.）。我们提出，基于此时间差，噬菌体的裂解活性可分为：（N）：噬菌体未引起测试细菌生长的任何延迟，生长曲线与对照相似；（D）：噬菌体引起测试细菌生长延迟少于五小时；DT < 5 小时，（D+）：噬菌体引起测试细菌生长延迟 5 小时或以上；DT ≥ 5 小时，和（C）：噬菌体在 24 小时后完全抑制细菌生长。
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