摘要
磺胺类抗生素和群体感应抑制剂可能具有潜在的生态风险，因为混合使用它们已被提出用于抑制细菌产生抗生素抗性。本研究调查了在0-24小时内，单一及二元混合的QSI和SAs对费氏弧菌的时间依赖性毒物兴奋效应。虽然低剂量SAs刺激了LuxR蛋白的表达，但高剂量SAs可通过竞争性结合二氢蝶酸合酶来抑制细菌生长。此外，低浓度的苯并呋喃-3(2H)-酮与AinR蛋白结合，从而使N-辛酰高丝氨酸内酯信号分子有机会与LuxR蛋白结合以促进发光。混合物诱导的毒物兴奋效应可推测为SAs促进了LuxR蛋白的表达，而B3O增加了C8与LuxR结合的机会。我们的发现为毒物兴奋效应的机制研究及化学混合物的生态风险评估提供了新的见解。
1. 引言
抗生素因其强大的抗菌能力而被广泛用于医学和药理学。然而，由于细菌中抗生素抗性的发展和传播，抗生素治疗正变得低效。因此，正在开发替代的控制策略。这些策略之一便是使用群体感应抑制剂，它们能够破坏细胞间通讯以抑制细菌生长。一些天然和合成的QSI已经被探索，例如呋喃酮、吡咯烷酮和吡咯烷醇，它们是有效的细菌抑制剂。虽然QSI不能诱导细菌产生抗生素抗性，但其有限的可靠性和广谱性限制了QSI作为传统抗生素理想替代品的应用。尽管如此，一些研究人员报告称，与单独使用抗生素相比，联合使用QSI和抗生素可以增加细菌的敏感性。例如，Bjarnsholt等人发现，在铜绿假单胞菌感染小鼠肺的模型中，加入从大蒜中提取的QSI后，细菌对妥布霉素更敏感。然而，QSI和抗生素可能被释放到环境中，并且它们可能在极低浓度下对微生物产生毒物兴奋效应。因此，研究传统抗生素和QSI的联合使用（这是解决抗生素抗性问题的有效策略）并收集这些化合物的生态风险评估证据非常重要。
磺胺类抗生素被广泛用作抗菌和抗炎药物，尽管这些药物对微生物和整个环境有害。近年来，SAs的毒性已被频繁研究，且大多数研究集中于低剂量毒物兴奋效应以及SAs与其他一些抗生素联合使用的联合毒性。通过使用发光细菌费氏弧菌进行SAs的慢性毒性测试可以观察到毒物兴奋效应；这些测试揭示了以低剂量刺激和高剂量抑制为特征的剂量-反应关系。关于SAs毒物兴奋效应的一种可能的机制假设已被提出，指出SAs与LuxR蛋白的表达有密切关系，LuxR蛋白在细菌的群体感应中起重要作用。由于QSI抑制QS，因此SAs和QSI的联合毒性值得研究。研究了SAs和QSI对费氏弧菌的急性联合毒性（15分钟），并观察到相加、协同和拮抗效应，这可能是SAs和QSI对LuxR蛋白表达影响的结果。然而，SAs和QSI的低剂量混合物对环境微生物的慢性影响仍然未知。因此，本研究旨在回答以下问题：(1) SAs和QSI的混合物是否存在慢性毒物兴奋效应？(2) 如果存在，单一化合物和混合物的毒物兴奋效应有何不同？(3) 毒物兴奋效应如何随时间变化？
发光细菌是抗生素的典型靶生物，这些细菌的生物测定是确定各种抗生素毒性的可靠工具，正如Kavanagh所展示的那样。作为一种发光细菌，费氏弧菌是最早观察到QS现象的细菌，已被深入研究。图1展示了控制费氏弧菌生物发光的三个信号通路。以费氏弧菌为模型生物，本研究调查了六种SAs和一种QSI的单一及二元混合物在0-24小时内的毒性效应。我们旨在比较0-24小时内单一化学品和混合物对费氏弧菌的毒物兴奋效应，确定混合物的联合效应机制，并研究时间与毒物兴奋效应之间的关系。我们的发现有助于加深对SAs和QSI诱导的费氏弧菌毒物兴奋效应的理解，并为生态风险评估提供基础数据。
图1 控制费氏弧菌V. fischeri中LuxICDABEG发光操纵子的三个通路。(1) C6可与LuxR结合，LuxR-C6复合物可激活多个基因，包括负责发光和LuxR合成的LuxICDABEG基因座。(2) 在C8存在下有两种效应，即通过结合LuxR诱导发光基因表达，以及AinR-C8复合物磷酸化LuxU、磷酸化的LuxU再磷酸化LuxO的信号级联被抑制，从而导致LitR稳定产生，继而编码转录调节因子LuxR。(3) 在AI-2存在下，AI-2与LuxP之间的相互作用通过使LuxU失活来增加litR的转录。
2. 材料与方法
2.1. 测试化学品和生物体
六种SAs和一种QSI苯并呋喃-3(2H)-酮购自Sigma，未经进一步纯化（纯度≥99%）；这些化合物的详细信息列于表1。冻干的发光细菌费氏弧菌由中国南京中国科学院土壤科学研究所提供，并在4°C的琼脂斜面上复水并保存。
表1 测试药物的详细信息和稳定性结果。
| CAS 号 | 名称 | 缩写 | 结构式 | 相对分子质量 (g/mol) | 溶质损失 (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| 651-06-9 | 磺胺甲氧哒嗪 | SM | H₂N HN SO₂NH N OCH₃ | 280.3 | -1.15 |
| 127-79-7 | 磺胺甲嘧啶 | SMR | H₂N HN SO₂NH N CH₃ | 264.30 | -1.26 |
| 2447-57-6 | 磺胺多辛 | SDX | H₂N SO₂NH N OCH₃ OCH₃ | 310.33 | -1.59 |
| 723-46-6 | 磺胺甲噁唑 | SMX | NH₂ SO₂NH N O CH₃ | 253.28 | -0.95 |
| 144-83-2 | 磺胺吡啶 | SPY | H₂N SO₂NH N | 249.29 | -1.06 |
| 80-32-0 | 磺胺氯哒嗪 | SCP | NH NH₂ SO₂NH N Cl | 284.72 | -0.49 |
| 7169-34-8 | 苯并呋喃-3(2H)-酮 | B3O | O || C / \ O CH₂ \ / C || O | 134.00 | -4.7 |
2.2. 化学稳定性
通过使用HPLC测定测试化学品在24小时内的稳定性。24小时后化学品浓度的变化以溶质损失表示，并在表1中给出。结果显示所有物质的溶质损失均小于5%，因此所有剂量-反应均使用标称浓度计算。
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