2.3. 总RNA提取
对于转录组分析，YeO3-R1细菌在室温（22°C）下生长16小时，随后用新鲜LB以1:10稀释至总体积为10 mL。在孵育期间测量培养物的OD600，当达到0.6时，将培养物分成两个相同的部分。一部分用MOI为10的噬菌体φR1-37感染，另一部分作为未感染对照。接下来，两种培养样品在相同条件下孵育，并测量培养物的OD600以确保感染过程正常。从未感染培养物（阴性对照）和感染后不同时间点（2、5、10、15、21、28、35、42、49分钟）的感染培养物中取样（1 mL）用于RNA分离。使用SV总RNA分离系统从样品中分离总RNA。使用Bioanalyzer和RNA 6000 Nano Kit分析分离的RNA制剂的质量和核糖体RNA（rRNA）图谱。
2.4. RNA测序
RNA测序和数据分析在芬兰分子医学研究所（FIMM）技术中心测序单元进行。使用Ribo-Zero™革兰氏阴性菌rRNA去除试剂盒去除rRNA。在Illumina HISeq2000测序仪上进行双端测序，读取长度为90个核苷酸。RNA序列数据已存入基因表达综合数据库。
2.5. 计算和统计分析
原始测序读数在映射到宿主和噬菌体基因组之前进行了修剪和质量过滤，使用CLC Genomics Workbench v7.5.1。计算了对噬菌体和宿主基因组中每个非rRNA基因特征比对的总基因读数（TGR）。
如果TGR的倍数变化（log2FC）值的计算对数2值超过1.5或低于-1.5，并且阴性对照值小于样本平均计数值减去2个标准差或高于样本平均计数值加上2个标准差，则认为基因存在差异表达。在比较早期和晚期细菌反应时，使用学生t检验检验差异表达。如果p<0.01，则认为差异表达具有统计学意义。那些包含0分钟阴性对照的比较确实容易受到显著的培养偏差影响，因为该条件只有一个重复。
通过总计数归一化后，对φR1-37时间模式进行聚类分析如下。计算2-5分钟（早期）、10-21分钟（中期）、28-49分钟（晚期）TGR值的平均值，并以百分比值呈现，最高值设置为100%。根据最高平均值对应的阶段对基因进行分类。如果不同阶段之间的平均值差异小于40%，则认为基因未被调节。平均TGR<10的基因不再进一步考虑。
3. 结果与讨论
3.1. φR1-37感染过程的微生物学参数
先前已使用一步生长曲线法定义了噬菌体φR1-37感染的感染动态，显示隐蔽期持续40分钟，潜伏期持续50分钟。在此，我们使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪进一步分析了不同温度条件下噬菌体与宿主的相互作用。结果表明，φR1-37在所有研究温度下都能在YeO3-R1中建立感染，但其有效性随温度升高而增加（图1）。在4°C和10°C时，只有最高数量的噬菌体（即MOI=100）能够影响细菌生长。在10°C时，培养物被跟踪足够长时间，观察到细菌在孵育40至70小时之间缓慢裂解（图1）。
在较高温度下，感染也随着所使用的所有其他MOI值进行，细菌生长曲线很好地反映了MOI的范围。在16°C、22°C和37°C时，可以分别在（完全）裂解的培养物中于40、20和15小时后检测到细菌的再生长。这个实验表明，噬菌体φR1-37能够在广泛的温度范围内建立有效感染。在较高温度下，培养物完全裂解后出现的再生长很可能是由于噬菌体抗性细菌的出现。由于φR1-37的受体是LPS的OC，噬菌体抗性自发突变体以高频率出现。基于这些结果，用于RNA测序分析的样品是从室温孵育并以MOI=10感染的细菌中收集的。
图1. φR1-37感染对细菌生长的影响。在4°C、10°C、16°C、22°C和37°C下，用不同稀释度的噬菌体φR1-37感染后，小肠结肠炎耶尔森菌菌株YeO3-R1的生长曲线。每个点代表8个平行孔的平均值。使用MOI值表示感染。C+：未感染培养物；C-：无细菌的噬菌体培养物。
3.2. 转录分析的一般特征
为了评估从用φR1-37噬菌体感染的YeO3-R1细菌中分离的总RNA的质量和完整性，进行了Bioanalyzer（安捷伦）运行。结果表明，RNA质量足以进行文库制备和RNA测序。由于推测小肠结肠炎耶尔森菌O:3的23S rRNA存在断裂，无法计算RNA完整数值（RIN），因此通过目视检查样品质量。然而，Bioanalyzer电泳凝胶显示，随着感染过程的进行，RNA样品发生显著降解。大肠杆菌噬菌体T4不仅通过影响宿主基因的转录，还通过改变现有mRNA的稳定性来终止宿主基因的表达。虽然目前尚不清楚观察到的降解原因是什么，或者它是否延伸到rRNA之外，但可能是φR1-37使用类似机制接管宿主细胞代谢，从而改变不同宿主RNA种类的稳定性，导致其部分降解的结果。
为了分析转录组的变化，以链特异性方式将RNA测序读数比对到宿主和噬菌体基因组。我们的结果显示，宿主读数逐渐被噬菌体读数取代，从2分钟样本的3.27%开始，在最后一个时间点达到峰值15.71%（图2；表S1）。这与φKZ感染中发现的45%相比，噬菌体转录本的相对积累显著更低。
图2. 随时间推移的噬菌体和宿主转录本积累。在感染后的不同时间点，比对到小肠结肠炎耶尔森菌（YeO3-R1）和噬菌体（φR1-37）基因组的读数百分比。数据代表两次独立实验的平均值。
评估每个样本之间协方差的主成分分析（PCA）显示，后续时间点的样本之间逐渐分化，以及未感染的阴性对照与第一个时间点之间的显著差异。基于这些结果，可以将单个时间点样本合并为四组，以进行相关的统计分析：早期阶段（2和5分钟）、中期阶段（10、15和21分钟）、晚期阶段（28、35、42和49分钟）以及感染前立即采集的未感染阴性对照（0分钟）。重要的是，这些组代表从同一感染烧瓶中采集的技术重复。
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