Tat-SodA/SodA、Tat-SodB/SodB和Tat-SodC/SodC肽的表达
将原核表达载体pET28b-Tat-SodA/Tat-SodB/Tat-SodC和pET28b-SodA/SodB/SodC转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，并在37°C培养箱中孵育10-12小时直至可见阳性克隆。从每组中挑取一个克隆，接种于5 ml含有卡那霉素的LB培养基中，并在37°C下生长至对数生长期。然后将细胞稀释至OD600 nm = 0.8，并将5 ml细胞接种于150 ml含有卡那霉素的LB培养基中，在37°C下培养4-5小时，直至OD600 nm达到0.6-1.0。通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在30°C下诱导异源蛋白表达6小时。在诱导蛋白表达后的0、2、4和6小时收集细胞，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中进行超声处理，然后在12000 rpm下离心10分钟，并通过0.45 μm过滤器过滤。随后制备等体积样品，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹进行分析。所有实验至少重复三次。
蛋白质印迹分析
使用BCA蛋白质测定法测量总蛋白质浓度，等量样品通过15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并按照制造商的说明转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与小鼠来源的抗GAPDH抗体和抗His抗体在室温下孵育1.5小时，然后在室温下与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠二抗孵育1小时。使用化学发光底物鲁米诺试剂与X射线胶片曝光来检测免疫标记条带。使用ImageJ软件扫描并量化条带的光密度。
总超氧化物歧化酶活性测定
上述诱导的细菌细胞在0、2、4和6小时收集，用细胞裂解液在冰上裂解1小时，并在4°C下以12000 rpm离心10分钟。使用BCA蛋白质测定法测量总蛋白质浓度，等量样品用于按照制造商的说明，使用总超氧化物歧化酶测定试剂盒检测总超氧化物歧化酶活性。
细菌增殖活性测定
将原核表达质粒pET28b-Tat-SodA/Tat-SodB/Tat-SodC和pET28b-SodA/SodB/SodC转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，使用阳性菌落接种5 ml含有卡那霉素的LB培养基，并在37°C下振荡培养至对数生长期。将细胞稀释至OD600 nm = 0.4，分别加入诱导剂IPTG和百草枯至终浓度1 mM和4 mM。然后将细胞接种到细菌生长板中，在30°C下振荡培养24小时；使用Bioscreen C测量细菌生长曲线。使用Microsoft Excel和Origin 9.5软件分析数据。野生型、ΔSodA、ΔSodB和ΔSodC菌株的生长曲线也使用相同方法测量和分析。
mRNA转录水平测定
将原核表达质粒pET28b-Tat-SodA/Tat-SodB/Tat-SodC和pET28b-SodA/SodB/SodC转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，使用阳性菌落接种5 ml含有卡那霉素的LB培养基，并在37°C下振荡培养至对数生长期。将细胞稀释至OD600 nm = 0.8，将5 ml细胞接种到150 ml含有卡那霉素的LB培养基中，在37°C下振荡培养4-5小时，直至OD600 nm达到0.6-1.0。随后在30°C下用IPTG诱导6小时。在诱导蛋白表达后的0、3和6小时收集细胞，并按照制造商的说明使用总RNA提取试剂盒提取总RNA。
按照制造商的说明，使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒，以总RNA为模板进行逆转录反应。制备反应混合物，包括10 μl 2×上样缓冲液、1.2 μl oligo(dT)、2 μl RNA、0.2 μl MMLV和6.6 μl DEPC处理的ddH2O，并在65°C孵育30分钟，接着42°C孵育30分钟，然后85°C孵育10分钟。随后，使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒，按照制造商的说明，以总共100 ng cDNA为模板进行实时定量聚合酶链式反应。制备反应混合物，包括10 μl 2× Master Mix、0.08 μl正向引物、0.08 μl反向引物、2 μl cDNA、0.4 μl Taq DNA聚合酶和7.44 μl ddH2O，并使用表1所示的引物，按照以下程序进行RT-qPCR：95°C 3分钟一个循环，然后95°C 12秒、62°C 30秒、72°C 30秒，共40个循环。使用SDS 1.4软件基于2−ΔΔCt方法分析结果，并使用Origin 9.5软件进行直方图分析。
蛋白质纯化及圆二色性测定二级结构
将正确表达Tat标签蛋白和无Tat标签蛋白的细胞在4°C下以12000 rpm离心10分钟，沉淀用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。悬浮液用超声波破碎仪超声处理，并在4°C、12000 rpm下离心10分钟。上清液中加入适量的上样缓冲液以平衡pH和离子强度。用4-5个柱体积的上样缓冲液平衡Ni-NTA柱；加入样品上样缓冲液直至上样基线，然后用含有梯度浓度咪唑的缓冲液从柱上洗脱。最后，根据洗脱峰收集蛋白质样品，并通过SDS-PAGE进行鉴定。
随后，使用BCA蛋白质测定法检测纯化蛋白的浓度。将蛋白质在稀释缓冲液中稀释至5 mM，并使用圆二色性测定二级结构，然后使用Excel软件进行直方图分析。
统计分析
使用SPSS软件对数据进行统计分析；使用Student's t检验进行组间比较，显著性差异定义为P<0.05，而P<0.01代表高度显著性差异。
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