材料与方法
细菌菌株、培养基和质粒 本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表1。大肠杆菌细胞在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养，而乳酸乳球菌在M17葡萄糖培养基（G-M17）或化学限定培养基（CDM）中培养，培养基补充有1%葡萄糖（G-CDM）、1%纤维二糖（C-CDM）、1%乳糖（L-CDM）、1%半乳糖（Gal-CDM）、1%熊果苷（A-CDM）、1%半乳糖加1%纤维二糖（GalC-CDM）或1%乳糖与诱导浓度（0.01%）的纤维二糖（LC-CDM）。需要时，向培养基中添加氨苄青霉素（Amp；用于大肠杆菌为100μg ml⁻¹）或红霉素（Em；用于大肠杆菌为100μg ml⁻¹，用于乳酸乳球菌为5μg ml⁻¹）。固化培养基含有1.5%琼脂，必要时添加IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；用于大肠杆菌为1 mM）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；用于大肠杆菌为50μg ml⁻¹）。
claR缺失突变体和互补质粒的构建 通过携带与claR基因重叠的DNA片段的pGhost9与包含这些DNA片段的染色体区域之间的双交换创建突变体。使用适当的前向和后向引物对（表1）扩增重叠的DNA片段。使用引物claRPstI/claRERpr（表1）和ExTaq聚合酶扩增claR上游区域，并作为PstI/EcoRI片段克隆到pGhost9的相应位点中。使用引物claRERrv/claRSalI（表1）扩增claR下游区域，并作为EcoRI/SalI片段克隆到携带上游片段的载体中，产生pGhost9△claR质粒。将缺失质粒导入乳酸乳球菌IL1403和IL1403△ccpA。通过将携带pGhost9△claR的乳酸菌株的过夜培养物在新鲜G-M17-Em培养基中稀释10⁻³来强制同源重组。稀释的培养物在非允许温度（38°C）下的G-M17中培养2.5小时。在含有红霉素的G-M17琼脂平板上于38°C选择含有pGhost9△claR整合到染色体中的整合子。通过在允许温度28°C下在无抗生素条件下培养整合子至少100代，从乳酸乳球菌染色体中切除并去除整合载体。通过菌落PCR、对菌株Em敏感性的测定以及对包含缺失的claR基因的DNA区域进行测序，确认所得claR缺失菌株乳酸乳球菌IL1403△claR的遗传结构。
为了互补claR缺失，使用引物claRSmaf和claRPstR（表1）扩增带有其推定启动子区域的claR基因，克隆到pGEM-T中，并转入大肠杆菌TG1。分离所得质粒DNA，用PstI和SmaI消化，连接到用相同限制酶消化的pIL253上，并转入乳酸乳球菌IL1403△claR，产生IL1403△claRpIL253claR菌株。
克隆和测量yebE基因后推定内在终止子的活性 使用引物yebEterf和yebEterr（表1）扩增yebE下游类似于rho非依赖型终止子的DNA序列。按照先前描述的方法，将进一步的克隆程序导入携带编码儿茶酚2,3-双加氧酶的xylE基因的pGBT58（表1）中，并通过酶促测定测量其表达。其活性在三个独立实验中测定。作为参考点，还在野生型pGBT58载体中测量了儿茶酚2,3-双加氧酶的活性，该载体在xylE基因与其启动子之间不含终止子。
将推定的claR启动子区域克隆到luxAB基因上游 如先前所述，制备由pGEM-T、pJIM2374和包含推定claR启动子（控制luxAB基因）的非编码区域（用yebEterf和yebEterr扩增）组成的构建体。由于pGEM-T在革兰氏阳性细菌中不能复制，且pJIM2374不包含rep基因，将重组质粒pJIM2374claRp转入乳酸乳球菌LL302，其染色体中编码RepA蛋白。通过在对数生长中期在C-CDM中测量的荧光素酶活性，推断克隆区域中存在功能性启动子。
通过实时定量PCR相对定量基因表达 对于实时定量PCR（RT-qPCR），使用TRI Reagent（Sigma）按照制造商的说明，从25 ml在指数生长中期（OD600=0.6）收获的IL1403野生型菌株及其突变体（IL1403△ccpA和IL1403△claR）培养物中分离总RNA。细胞在G-CDM、C-CDM、Gal-CDM、A-CDM或GalC-CDM中生长。从至少三个独立培养物中提取RNA。
使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）按照制造商的说明，从经DNA酶I（Sigma）处理的2μg RNA样品合成第一链cDNA。