摘要. 某些泛菌属菌株被用作生物防治剂以抑制植物病害。然而，由于生物安全方面的担忧，它们在部分国家的商业注册受到阻碍。本研究采用表型分析方法比较了临床来源和植物有益来源的泛藻凝集菌及相关物种的菌株，评估了其植物有益效应、在线虫模型中的不良效应以及毒性。植物有益效应通过抑制扩展青霉对苹果果实的侵染以及解淀粉欧文氏菌对苹果花的侵染来确定。临床菌株对植物病原真菌或细菌的侵染没有普遍的抑制活性，仅有一个临床菌株抑制了扩展青霉，三个抑制了解淀粉欧文氏菌。相比之下，所有生物防治菌株都显示出对至少一种植物病原菌有活性，并且有三个菌株对两种病原菌均有活性。通过植物寄生线虫爪哇根结线虫和以细菌为食的线虫秀丽隐杆线虫评估了对动物的不良效应。两种模型均表明两种临床菌株具有不良效应，但所有植物有益菌株均未显示不良效应。通过血液溶血活性评估毒性，并通过艾姆斯试验评估遗传毒性。无论是临床还是植物有益菌株，均未显示任何毒性证据。
引言
泛藻凝集菌（以前称为凝聚肠杆菌、草生欧文氏菌或粟疫欧文氏菌）是一种革兰氏阴性肠杆菌，经历了多次分类学上的重新排列，汇集了来自不同生态来源的菌株。泛藻凝集菌是一种普遍存在的附生细菌，可在多种植物物种上发现。它也经常从动物或人类临床样本中分离出来。从植物环境中分离的泛藻凝集菌和泛菌属vagans种（以前包含在泛藻凝集菌内）的某些菌株是抑制植物病原细菌和真菌引起的植物病害的最有益的生物防治剂之一。已有几种此类菌株被开发用作微生物生物农药的活性成分，注册为防治由解淀粉欧文氏菌引起的火疫病的植物保护产品。
临床报告暗示泛藻凝集菌是一种机会性人类病原体，但这些报告通常是描述性的，表明存在多种微生物混合分离，并且缺乏对病原性或疾病中因果作用的验证。许多临床菌株的不准确鉴定进一步夸大了泛藻凝集菌与人类感染的关联。虽然有时被报道为植物病原菌，但属于致病变种 gypsophilae 和 betae 的菌株已被证明是真正的植物病原菌，符合柯赫氏法则。携带毒力因子（例如，III型分泌系统基因）的质粒是植物致病性的原因，这些质粒存在于上述两种菌株中，但不存在于其他植物和临床菌株中。
生物农药作为化学/抗生素植物保护产品替代品的注册监管决策依赖于现有数据。目前，在欧洲，泛藻凝集菌被归类为生物安全等级2的物种，这排除了其被考虑用于有益应用的可能性。然而，与对其他细菌物种（例如，粘质沙雷氏菌、洋葱伯克霍尔德菌和铜绿假单胞菌）的众多研究相比，只有少数研究比较了有益菌株和临床菌株。
最近的比较分子和生化分析报告发现，临床和植物来源的严格意义上的泛藻凝集菌菌株之间没有明确区分。根据标准微生物学、代谢或生化特征、总基因组或部分基因组DNA的模式多态性、单基因座序列分析或DNA-DNA杂交，临床和生物防治菌株聚集在一起。临床和生物防治菌株在定殖大豆根或鸡胚能力方面也未显示差异。菌株C9-1和E325在美国的注册，以及菌株P10c在新西兰的注册，证明了其缺乏动物致病性，但这些数据是专有的，并未扩展到菌株比较。
我们研究的目的是用表型比较来补充基因型分析，对比泛菌属临床菌株和植物有益菌株。基于溶血、遗传毒性和线虫感染性对菌株进行比较。使用针对植物病原真菌和细菌的生物防治模型评估了对植物生境的差异适应性。
材料与方法
泛藻凝集菌菌株和生长条件。 使用了十二个泛藻凝集菌菌株和泛菌属vagans种C9-1，包括临床分离株和先前描述具有防治植物病害有益活性的植物附生菌株（表1和表2）。临床分离株包括模式菌株ATCC 27155以及其他来自研究或菌种保藏中心的菌株。植物有益细菌是那些典型的生物防治菌株，它们要么是商业化的，要么已经过大量研究。所有菌株先前均基于生化测试结果被鉴定为泛藻凝集菌。根据16S rRNA基因序列，这些菌株属于泛藻凝集菌（包括泛菌属vagans种菌株C9-1），但EM13cb和EM17cb除外，它们与泛藻凝集菌亲缘关系密切，但不是该物种的成员。
| 菌株 | 植物寄主/材料 | 来源国家 | 目标病害 | 毒理学 CFU/kga | 鉴定为泛藻凝集菌 (Phoenix, 16S rRNA, gyrB, MALDI-TOF MS)b |
| CPA-2 | 苹果果实表面 | 西班牙 | 采后腐烂病 | ≥4.3×1011 | nd+++ |
| EPS125 | 梨果实表面 | 西班牙 | 采后腐烂病 | >1010 | nd+++ |
| C9-1 | 苹果茎 | 美国 | 火疫病 | 5×1011 | ++-- |
| P10c | 苹果花 | 新西兰 | 火疫病 | nr | nd+++ |
| Eh252 | 海棠 | 美国 | 火疫病 | nr | ++-- |
| Eh318 | 苹果茎 | 美国 | 火疫病 | nr | nd+++ |
| Eh1087 | 苹果花 | 新西兰 | 火疫病 | nr | nd+++ |
毒理学，对哺乳动物的急性口服毒性；nr，菌株C9-1见美国环保署代码006470。 +，阳性结果；-，阴性结果；nd，未做
表2. 本研究中使用的临床来源泛藻凝集菌菌株的相关特征
| 菌株 | 来源国家 | 来源材料 | 感染性质 | 鉴定为泛藻凝集菌 (Phoenix, 16S rRNA, gyrB, MALDI-TOF MS)b |
| ATCC 27155 (LMG 1286) | 津巴布韦 | 膝盖 | 撕裂伤 | ++++ |
| CIP A181 | 法国 | 血液 | 菌血症 | +++ |
| VA21971 | 瑞士 | 伤口 | 伤口感染 | +++ |
| EM13cba | 西班牙 | 血液 | 菌血症 | +--- |
| EM17cba | 西班牙 | 血液 | 菌血症 | +--- |
| EM22cb | 西班牙 | 血液 | 菌血症 | ++++ |
a基于Phoenix分析，这些菌株是泛藻凝集菌，但16S rRNA、gyrB和MALDI-TOF质谱分析不支持该鉴定；相反，EM13cb属于显眼泛菌，EM17cb属于嗜花泛菌。 +，阳性结果；-，阴性结果。
基于Phoenix分析，它们是泛藻凝集菌，但结合16S rRNA测序，gyrB分析和MALDI-TOF质谱将它们置于接近但又与泛藻凝集菌不同的位置；实际上，基于二元数据，EM13cb是显眼泛菌，EM17cb是嗜花泛菌。包括gyrB在内的管家基因序列分析证实了泛藻凝集菌菌株的身份，并将C9-1归属于泛菌属vagans种。选择本研究的菌株以代表不同的分离环境（人类/植物、组织、国家）以及在生化特性（Phoenix, MALDI-TOF质谱）和gyrB序列方面的变异性。菌株从-80°C保存的培养物中复苏，并在25°C的LB琼脂上培养过夜。从琼脂表面刮下菌落，悬浮于无菌蒸馏水中。将细胞培养物调整至细胞密度相当于1 x 10^8 CFU/ml。通过用无菌蒸馏水稀释制备适当的浓度。
蓝霉病的生物防治，一种由扩展青霉引起的采后腐烂病。 使用扩展青霉EPS46进行蓝霉病感染抑制试验，并在4°C的PDA上保存。从在25°C黑暗条件下培养7天的PDA培养物中收集分生孢子。用湿润棉签刮下菌落，并重悬于含有0.5% Tween 80的蒸馏水中。使用血球计数器将孢子浓度调整至10^4孢子/ml，每次试验使用新鲜悬浮液。苹果（Malus x domestica L. 'Golden Delicious'）在使用前通过浸入稀释的次氯酸钠（1%有效氯）中1分钟进行表面消毒，用无菌水冲洗两次，并风干。
用火焰灭菌的3毫米直径打孔器在果实中部等距离的三个点造成均匀深度为5毫米的伤口，然后将果实放在塑料孵化盒中的聚苯乙烯垫上。每个伤口首先接种50μl泛菌属菌株的细菌悬浮液（1 x 10^8 CFU/ml），并在约100%相对湿度的密封盒中于20°C孵育24小时。然后每个伤口接种20μl扩展青霉悬浮液（1 x 10^4分生孢子/ml），并孵育5天。未处理的对照包括接种水或单独接种病原体的果实。处理包括三个重复，每个重复三个果实（三个伤口），并在两个独立试验中采用完全随机设计。在接种5天后，测定每个重复的病害发生率作为感染伤口的百分比。
由解淀粉欧文氏菌引起的火疫病的生物防治。 使用苹果花评估对解淀粉欧文氏菌EPS101的生物防治活性，遵循Cabrefiga和Montesinos的方法。从西班牙赫罗纳Mas Badia农业试验站的实验果园采集新开放的梨花。将单个花朵连同切下的花梗浸入含有1毫升10%蔗糖溶液的1.5毫升Eppendorf塑料管中。将装有花朵的管子放在置于孵化盒中的管架中。用20μl泛菌属悬浮液（1 x 10^8 CFU/ml）处理花托，并在约100%相对湿度的密封盒中于20°C孵育过夜。然后在花托上接种10μl浓度为1 x 10^7 CFU/ml的解淀粉欧文氏菌悬浮液，并按上述方法孵育5天。未处理的对照包括水或单独接种病原体的处理。
处理包括三个重复，每个重复八朵花，并在两个试验中采用完全随机设计。在接种5天后评估病害严重程度，使用0到3的严重程度等级，其中0表示无症状；1表示花托部分坏死；2表示花托完全坏死；3表示坏死通过花梗进展。数据分析包括计算每个重复的平均病害严重程度和实验内观察到的最大严重程度。
对线虫的不良影响。 研究了泛菌属菌株对植物寄生线虫爪哇根结线虫的毒性以及对以细菌为食的线虫秀丽隐杆线虫的致病性。
通过在温室中定期（每2-3个月）转移到新的植物材料上，在番茄植株的根系上维持一个爪哇根结线虫种群。在每次试验前，按照Cobb的方法从根瘤中收集爪哇根结线虫卵。测量收集的悬浮液体积，并使用计数室在40倍放大倍数下测定卵浓度。通过向悬浮液中加入次氯酸钠（3%有效氯）并轻轻摇动20分钟来消毒爪哇根结线虫卵悬浮液。将卵收集在无菌500目筛上，并用无菌蒸馏水冲洗以去除残留的次氯酸钠。将卵在20°C通气48小时以诱导孵化；收集第二龄期幼虫并调整浓度。从离心（10,000 xg，15分钟）的48小时泛藻凝集菌液体LB培养物中制备细菌细胞悬浮液和无细胞培养上清液。
将细胞沉淀重悬于含有（每升）5克葡萄糖、1克NH4Cl、3克KH2PO4、2.4克Na2HPO4、0.5克NaCl和0.2克MgSO4（pH 7.0）的葡萄糖基本培养基中。将浓度调整至1 x 10^8 CFU/ml。从沉淀物中分离培养上清液（细菌培养物提取物），并通过0.22μm孔径的滤膜过滤。通过将100μl爪哇根结线虫J2悬浮液（2000条幼虫/ml）放入30ml无菌管中，并加入100μl细菌悬浮液和1.8ml无菌GMM，或加入1.9ml无细胞培养上清液来进行毒性测定。
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