2.5.分离株作为潜在益生菌的表征
2.5.1.拮抗活性检测
通过琼脂点种试验和琼脂扩散法测定拮抗活性（Schillinger和Lucke，1989）。简而言之，对于间接拮抗作用，将测试乳酸杆菌的20μl点样在0.2%-葡萄糖MRS琼脂（MRS-0.2）上，在厌氧条件下于37°C培养24小时。随后，将指示菌菌苔（对于病原体使用含有0.6%酵母提取物的胰蛋白酶大豆琼脂，TSAYE（Difco Laboratories，底特律，密歇根州，美国）（单核细胞增生李斯特菌三菌株混合物：CTC1011血清型1/2c、CTC1034血清型4b和CECT4031血清型1a，以及三种沙门氏菌肠道血清型：London CTC1003、Derby CTC1022和Typhimurium GN6，分别测试）和对于清酒乳酸杆菌CTC494（一种在发酵香肠中用作发酵剂且具有抗李斯特菌活性的菌株）使用MRS（Merck））倒在生长好的点样上。平板在厌氧条件下于30°C（对于清酒乳酸杆菌CTC494）或37°C（对于病原体）培养。24小时后读取抑制圈。同时培养测试菌和指示菌以检测直接拮抗作用。简而言之，将MRS-0.2平板覆盖7 ml接种了病原体/清酒乳酸杆菌CTC494的TSAYE/MRS软琼脂。随后，将培养在MRS中的乳酸杆菌点样（20μl/菌株）到菌苔上。平板在37°C下培养24小时，分别在有氧（对于病原体）或厌氧（对于清酒乳酸杆菌）条件下。
在两种测定（直接和间接）中，点样周围清晰区大于1mm记为阳性，并对显示对病原体有拮抗作用的菌株进行琼脂扩散法测定。对于此测定，将细菌素筛选基础琼脂平板（牛肉提取物，20 g/l；葡萄糖，20 g/l；琼脂，15 g/l）覆盖单核细胞增生李斯特菌或沙门氏菌的过夜培养物在TSAYE软琼脂（Difco）中。在琼脂中切割直径3mm的孔，并加入30μl所选菌株的巴氏消毒（95°C/10分钟）并中和的上清液。平板在37°C下培养24小时。孔周围的清晰区被认为是阳性。
2.5.2.酸度、胰酶和胆汁的影响
在pH用HCl调节至3.5的MRS肉汤（Merck）中评估酸度的影响。使用MRS（Merck，pH 5.7）作为对照培养基。两种培养基均以1%接种测试菌株的过夜培养物，并在37°C的摇动水浴中培养3小时。在37°C培养0、1、2和3小时后测量OD600 nm。此外，在培养0和3小时后在MRS琼脂上进行平板计数。按照Ronka等人描述的方法评估对胰酶的耐受性。在测试培养基（150 mM NaHCO3和1.9 mg/ml胰酶（Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国）；pH 8）中培养0和3小时后，通过平板计数在MRS琼脂（Merck）上检查菌株的存活情况，反映了食物在小肠中的平均停留时间。通过将20μl乳酸杆菌过夜培养物划线在MRS Oxgall琼脂（AES chemunex，Bruz，法国）上并在厌氧条件下于37°C培养24小时来确定在胆汁存在下的生长能力。
2.5.3.酪胺产生
使用Bover-Cid和Holzapfel描述的脱羧酶培养基评估乳酸杆菌形成酪胺的能力。为了诱导酶，在含有0.1%酪氨酸（Sigma）和0.005%吡哆醛-5-磷酸（Sigma）的MRS肉汤中将乳酸杆菌传代培养5次，然后进行筛选试验，其中将20μl每种菌株点样在脱羧酶琼脂上，并在厌氧条件下于37°C培养3天。阳性结果表现为培养基颜色变为紫色并在点样周围出现清晰的光环。
2.5.4.抗生素敏感性测试和MIC测定
通过Etest®方法（AB BIODISK，索尔纳，瑞典）测定最低抑菌浓度（MICs）。通过将单个菌落悬浮在无菌0.85%NaCl溶液中至McFarland标准1来进行测定。将悬浮液在LSM琼脂[90%isosensitest（Oxoid Ltd.，贝辛斯托克，英国）和10%MRS（Merck）（Klare等人，2005）]上以三个方向涂抹，并在应用Etest条之前晾干。在37°C厌氧培养48小时后记录读数。通过CLSI和Klare等人描述的肉汤微量稀释法确认通过Etest®获得的卡那霉素抗性菌株对卡那霉素的MIC。
2.5.5.聚集测试
按照Reniero等人描述的方法进行聚集测试。在室温下培养2小时和20小时后，当明显可见的沙状颗粒沉淀到试管底部时，聚集记为阳性。使用唾液乳酸杆菌CTC2197作为阳性对照。
2.5.6.酶活性
每种测试菌株在MRS琼脂（Merck）上于37°C厌氧培养48小时。根据制造商的说明，使用API ZYM gallery系统（BioMerieux，Mercy l'Etoile，法国）测定菌株的酶活性。颜色强度（从1到5）允许区分阳性（3-5）和阴性（1-2）结果。
2.6.模型香肠制作
将肉（80%瘦猪肉+20%猪背膘，通过6mm孔板在-1/0°C下绞碎）与以下成分混合（以g/kg计）：NaCl，25；NaNO2，0.15；KNO3，0.15；抗坏血酸钠，0.5；葡萄糖，7；黑胡椒，3；水稀释的细菌培养物，2.6 ml/kg。制备了七个独立的批次：六个批次接种不同的乳酸杆菌菌株（发酵乳酸杆菌CTC1693、类干酪乳酸杆菌/副干酪乳酸杆菌CTC1677、类干酪乳酸杆菌/副干酪乳酸杆菌CTC1678、鼠李糖乳酸杆菌CTC1679、加氏乳酸杆菌CTC1700和加氏乳酸杆菌CTC1704），接种量为10^6 CFU/g，以及一个对照批次（未接种）。将100克肉馅部分真空包装在PET/PE袋中以模拟灌肠，并在15°C下培养9天。在第0、6和9天对重复样品进行pH测定和MRS计数。为了监测接种菌株的存在，在第6天和第9天从MRS平板上分离每个样本4个菌落（每批8个菌落），并按照第2.2节所述使用引物KS进行RAPD-PCR。
2.7.统计分析
使用SAS软件（SAS Enterprise Guide 4.2，SAS Inst.，卡里，北卡罗来纳州，美国）进行统计分析，以确定在Bioscreen C微生物生长曲线分析仪测定中使用的菌株的生长速率、延迟期和TTD的显著差异。对数据进行方差分析（ANOVA），并通过事后Tukey检验评估效应之间的差异。显著性水平设定为p<0.05。根据基于二项分布的抽样计划（Pena Sanchez de Rivera，1986）确定给定接种菌株的定植百分比。定植断点，定义为显示与亲本菌株相同RAPD谱的菌落百分比，设定为80%。
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