2.3.2酶敏感性
如图2所示,与对照组相比,植物乳杆菌代谢物经过胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后抑菌圈直径显著下降(P<0.05),抑菌活性分别丧失了6.8%、4.93%。说明植物乳杆菌代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株具有抑菌活性的物质中,存在对蛋白酶敏感的抑菌物质,推测为蛋白或肽类物质,但蛋白酶处理后其相对抑菌活性仍>90%,说明起主要作用的可能是非蛋白类的其他物质。
图2酶处理对SCB2505代谢物抑菌活性的影响
与对照组相比,SCB2505代谢物经过氧化氢酶处理后抑菌圈直径显著下降(P<0.05),抑菌活性丧失了6.16%,说明SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株具有抑菌活性的物质中,存在过氧化氢,但过氧化氢酶处理后其相对抑菌活性仍>90%,说明其中含有过氧化氢,但该物质并非主要抑菌活性物质。可见,蛋白酶、过氧化氢酶均能影响SCB2505代谢物对指示菌的抑菌活性,但处理后相对抑菌活性均大于90%,由于蛋白类和过氧化氢对高温较为敏感,这可能是代谢物在热稳定性测试中抗菌活性部分丧失的原因。
2.3.3 pH敏感性
如表3所示,与不调节pH的代谢物(CK组)相比,将pH值调整为3.0时代谢物抑菌效果最强,且显著优于CK组(P<0.05),而pH值为5.0、7.0、9.0时,代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株均不显示抑菌能力。可见,pH对植物乳杆菌SCB2505代谢物的抑菌活性具有显著影响,且随着pH降低,抑菌活性上升,说明该菌株发酵过程中产生的有机酸在抑菌活性中发挥重要的作用,但有机酸和氢离子浓度在抑菌过程中发挥的作用还需要进一步验证。
表3 pH对植物乳杆菌SCB2505代谢物抑菌活性的影响
注:采用t检验分析实验组及对照组抑菌效果的显著性差异(P<0.05),以*表示;“-”表示没有出现抑菌圈。
2.3.4乳酸验证试验
由表4可知,植物乳杆菌SCB2505代谢物具有较好的抑菌活性,抑菌圈直径达到(18.75±0.11)mm(A)。MRS液体培养基(E)不具有抑菌活性,但用乳酸将MRS调至与A组相同的pH(B)时,抑菌圈直径达到(15.37±0.24)mm,其抑菌活性大大提高,与对照组(A)比较相对抑菌活性为81.97%。但是,与A组(植物乳杆菌SCB2505代谢物组)相同pH的乳酸水溶液(C)不具有抑菌圈,而添加与B组相同乳酸添加量的水溶液(D)抑菌圈直径达到(14.73±0.37)mm,与B组不具有显著性差异(P>0.05)。由此可见,在中酸性环境下,氢离子浓度(即pH值)并不是影响代谢物抑菌活性的主要原因,其抑菌活性主要是乳酸所起的作用。在相同pH值下,低浓度的乳酸水溶液不具有抑菌活性,而在MRS体系中,由于乳酸与MRS中的缓冲物质中和,导致乳酸根离子累积,随着pH下降,氢离子与乳酸根离子反应形成未解离的乳酸,乳酸浓度超过阈值,从而使其产生抑菌活性。据报道,未解离的乳酸具有亲脂性,能过穿过细胞膜,在细菌内释放氢离子,降低细菌内pH值,进而影响细菌的生长速度。此外,乳酸还可以通过破坏酶、抑制蛋白质合成、中断营养吸收、破坏细胞壁和细胞膜的亚结构和功能来影响细胞代谢,破坏细胞生长。
表4不同情况下乳酸对指示菌抑菌效果对比实验结果图
注:A-未处理的代谢物溶液(pH=3.54);B-乳酸处理的MRS;C-乳酸溶液(pH=3.54);D-与B等量乳酸的水溶液(pH=2.32);E-未处理的MRS;采用t检验分析实验组与对照组(A)的显著性差异(P<0.05),以*表示,“-”表示没有出现抑菌圈。
结合2.3节对抑菌物质的分析,推测植物乳杆菌代谢物中的乳酸为主要抑菌物质,过氧化氢、细菌素则发挥协同作用,且其需要在酸性(pH<5.0)的条件下才能发挥抑菌活性。
2.4 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株生物被膜的影响
生物被膜是由细菌或真菌分泌的一层能包裹自身群落的外膜,由胞外聚合物组成。其成分复杂,能够保护膜内菌体抵御外界环境变化及一些抗生素的作用,具有很强的耐受性。如图3所示,当代谢物浓度在0.5 MIC时,抑制率为17.29%;浓度在1.0 MIC时,抑制率为68.50%,与0.5 MIC组相比,生物被膜抑制效果明显上升(P<0.05),代谢物浓度上升到2.0 MIC时,抑制率上升至为74.00%,但与1.0 MIC相比差异不显著(P>0.05)。说明植物乳杆菌SCB2505代谢物能够抑制指示菌生物被膜生成,且呈现一定的梯度依赖关系,但代谢物浓度上升到1.0 MIC后,抑菌效果基本不变。
图3 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株生物被膜的影响
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
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