2.材料与方法
2.1.菌株和生长培养基
使用以下酵母菌株：FY1679-11C（MATa;ura3-52;leu2D 1;TRP1;his3D200;GAL2）和Dyfh1菌株FKEN015-01A（AL）（FY;Matα;ura3-52;his3.200;leu2.1;LYS2;TRP1;YDL120w（4531）::kanMX4）（来源：Euroscarf，德国法兰克福）。
菌株在30°C和250 rpm下在以下培养基中生长：丰富的YPD培养基（2%葡萄糖，2%细菌蛋白胨和1%酵母提取物）和YPR培养基（葡萄糖被2%棉子糖替代）。合成缺失（SD）培养基（0.67%无氨基酸酵母氮源，2%葡萄糖和0.077%完全补充混合物CSM-尿嘧啶）。SR培养基（葡萄糖被2%棉子糖替代）。SG培养基（葡萄糖被2%半乳糖替代）。培养基用2%琼脂固化。
2.2.构建完整的铁蛋白克隆
使用特异性引物（5'-ctacgagcgtctcctgaagatgc-3'和5'-cgcggatccaagtcgctgggctcagaaggctc-3'）从肝癌cDNA文库中扩增出包含完整人FL基因（750 bp）并在两侧带有NotI限制性位点的PCR片段。该片段直接克隆到TOPO载体中，然后亚克隆到酵母表达载体pSCGAL10-SN的NotI位点中。
2.3.Northern印迹分析
按照FastTrack™2.0方案，从在SD、SR或SG培养基中呈对数生长的酵母细胞中制备酵母总RNA。对于Northern印迹，将mRNA（每个样品15μg）在琼脂糖凝胶中分离并印迹到Hybond-N膜上。探针包括用High Prime标记的32P PCR扩增的铁蛋白片段，而酵母肌动蛋白（ACT1）探针用作内参。使用LumiAnalysis图像分析软件分析Northern印迹。
2.4.通过显微操作确定寿命
按照所述方法进行寿命分析，并进行以下微小修改。将细胞在SD培养基（2%葡萄糖）上预培养，转移到SR培养基（2%棉子糖）中，并培养至少两代。从该液体培养物中取出呈对数生长的细胞，以低密度转移到YPR平板上。然后将细胞在30°C下培养过夜。通过显微操作分离处女代细胞作为芽，并用作寿命分析的起始母细胞。随着每次连续移除子代细胞，母细胞被计数为增加一代。细胞在白天于30°C培养，夜间保持在4°C。每个实验至少包括60个细胞。通过Wilcoxin检验进行寿命的统计分析。当p<0.01时认为差异显著。
2.5.细胞生长曲线
将细胞在液体SD培养基（2%葡萄糖）中于30°C和250 rpm下培养过夜。通过测量OD600监测细胞密度。通过以8000 rpm离心10分钟收集细胞，并用合成缺失S培养基（无葡萄糖）洗涤两次。将细胞用S培养基稀释至OD600 5.0。将每种培养物的5微升接种到总体积为400微升的培养基中。根据供应商的方案，使用Bioscreen测量细胞生长速率。细胞在30°C下培养72小时，每隔10分钟以中等强度间歇振荡10秒。每小时测量一次光密度，并自动生成生长曲线。
2.6.羰基化测定
从在补充了各种氧化剂的SR培养基（2%棉子糖）中呈对数生长的细胞中制备粗细胞提取物。使用Bicinchoninic Acid（BCA）蛋白质测定法测量蛋白质浓度。根据OxyBlot蛋白质氧化检测试剂盒的方案进行蛋白质的氧化修饰。通过用2,4-二硝基苯肼（DNPH）与羰基反应，用2,4-二硝基苯腙（DNP-hydrazone）标记羰基化蛋白质。为了可视化，将DNP衍生的蛋白质点样到硝酸纤维素膜过滤器上，然后使用对DNP部分特异性的抗体（兔抗DNP抗体）进行检测。使用辣根过氧化物酶偶联的二抗（山羊抗兔）结合SuperSignal化学发光进行检测。使用LumiAnalysis图像分析软件分析信号。
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