结果
不同病因脓毒症患者的HBP和抵抗素反应。首先，我们测量了由不同细菌引起的严重脓毒症/脓毒性休克患者急性期血浆中的HBP和抵抗素水平。结果显示，与非感染危重患者相比，脓毒症患者（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌感染）的这两种因子水平均显著升高。革兰氏阳性感染患者与革兰氏阴性感染患者之间的HBP或抵抗素水平无显著差异。然而，与革兰氏阴性队列相比，革兰氏阳性队列显示HBP和抵抗素之间的相关性更强。革兰氏阳性感染主要由肠球菌或金黄色葡萄球菌引起，但不包括任何链球菌感染。由于据报道GAS对中性粒细胞有强烈影响，一个由链球菌脓毒性休克患者（即GAS STSS患者）组成的独立患者队列也被分析。与脓毒性休克队列类似，在STSS患者血浆中检测到高水平的HBP和抵抗素，并显示出更强的相关性。
图1：脓毒症患者的全身和局部HBP与抵抗素反应。 通过ELISA测量纳入当天收集的患者血浆中的HBP和抵抗素水平，详情见实验程序。(A, B) 严重脓毒症/脓毒性休克患者 (n=88) 或非感染危重患者 (n=31) 血浆中的HBP和抵抗素水平。(C) 确诊为革兰阳性 (G+) 或革兰阴性 (G-) 感染的严重脓毒症/脓毒性休克患者 (n=48) 血浆中的HBP和抵抗素水平。(D) STSS患者 (n=8) 的全身性HBP和抵抗素水平。通过Pearson相关性检验确定相关性，以p值和r值表示。(E) 通过对GAS引起的严重软组织感染患者 (n=9) 的速冻组织活检冰冻切片进行免疫组织化学染色，分析HBP、抵抗素、巨噬细胞和中性粒细胞。同时进行了省略一抗的对照染色（对照）。显示了一个代表性组织活检。比例尺表示50μm。(F) 通过显微镜和获取的计算机图像分析（ACIA）评估染色结果，详情见实验程序。通过Spearman检验确定显著相关性，以p值和r值表示。
为了进一步验证GAS感染患者全身性HBP和抵抗素之间存在如此强相关性的发现，进行了研究以分析这些在局部感染部位的反应，即在感染的软组织中。数据来自先前分析的从GAS坏死性筋膜炎或严重蜂窝织炎患者收集的速冻组织活检。通过细胞内免疫组织化学染色分析了组织活检中HBP或抵抗素的表达以及吞噬细胞浸润。如先前报道，在所有感染活检中检测到巨噬细胞、中性粒细胞、HBP和抵抗素。这与健康对照皮肤活检中仅发现少量抵抗素阳性细胞形成对比。与上述循环数据一致，相关性检验显示感染组织部位HBP和抵抗素之间存在显著相关性。
HBP和抵抗素对炎症反应的叠加效应。接下来，我们测试了HBP和抵抗素的抗菌和免疫刺激特性。使用Bioscreen C微生物生长分析仪测量含有0.1-5μg/ml HBP或0.1-2μg/ml抵抗素浓度范围的培养物浊度，评估了对GAS、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。在存在或不存在抵抗素或HBP的情况下，观察到GAS和金黄色葡萄球菌的相似OD曲线；因此，排除了任何抗菌作用。与先前报道的HBP对革兰氏阴性菌的抗菌活性一致，大肠杆菌在对数生长期OD略有降低，而添加抵抗素时生长无变化。由于HBP和抵抗素均已被报道具有促炎活性，研究这些因子是否存在潜在的叠加或协同效应很有意义。为此，用HBP或抵抗素，或两种蛋白的组合刺激健康供体的PBMC。在培养上清液中测量了经典的脓毒症相关促炎细胞因子IL-8。
图2：HBP和抵抗素在体外诱导显著的炎症反应。 用不同组合的HBP（50或500 ng/ml）和抵抗素（50 ng/ml）单独或联合刺激健康供体的PBMC。对细胞培养上清液进行Luminex分析检测IL-8水平。(A) 使用一名供体细胞进行的一次实验结果。(B) 显示了用HBP（500 ng/ml）和抵抗素（50 ng/ml）单独或联合刺激六名供体的结果；每位供体用不同的符号表示。此处IL-8反应以刺激指数（SI, %）表示，即刺激值除以未刺激值。使用Mann-Whitney U检验进行组间比较，差异以p值显示。
如图2所示，与单独每种蛋白相比，用HBP和抵抗素组合刺激的细胞上清液中的IL-8水平显著更高。因此，结果表明HBP和抵抗素在诱导炎症反应中具有叠加效应。
我们同时检测了脓毒症队列中的IL-8水平，正如预期那样，所有队列均检测到升高水平（中位数ng/ml（范围）；STSS：626（306-1985）；革兰氏阳性脓毒症：225（28-1611）；革兰氏阴性脓毒症：118（51-2118））。
值得注意的是，在STSS患者中观察到IL-8水平与HBP（r=0.84，p=0.009）以及IL-8与抵抗素（r=0.86，p=0.006）之间存在强相关性，而其他脓毒症队列中未发现明显相关性。许多功能包括抗菌和免疫刺激活性。重要的是，作为血管渗漏的有效诱导剂，HBP被认为是循环衰竭和低血压病理生理学中的核心角色10,11，从而使严重感染复杂化。抵抗素，一种富含半胱氨酸的脂肪细胞因子，在人类中已被确认为与急性和慢性炎症状况相关的有效促炎分子12-14。我们报道了抵抗素作为脓毒症严重程度的标志物，其分泌特征相较于早期细胞因子更为持久，且在脓毒性休克患者中观察到最高的全身抵抗素水平6。中性粒细胞被确定为脓毒症患者抵抗素的一个新的主要来源15。
中性粒细胞被GAS（而非金黄色葡萄球菌或大肠杆菌）激活后，会释放大量HBP和抵抗素。临床数据显示中性粒细胞反应因病原体而异，因此我们比较了不同细菌刺激物触发中性粒细胞活化和脱颗粒的能力。为此，我们将从健康献血者分离的原代人中性粒细胞暴露于不同的临床感染性休克分离株（即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和GAS）。使用过夜培养制备的过滤细菌上清液和固定细菌刺激中性粒细胞2小时，随后检测细胞培养上清液中的HBP和抵抗素。对暴露于固定细菌的中性粒细胞进行可视化观察发现，GAS引发了几乎完全的细胞聚集，反应模式存在显著差异。
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