2.4.MT检测
通过气相色谱法测量气相中的MT浓度，通过顶空进样器联用GC测量液相中的MT浓度。从北京Q&Q Technologies购买氮气中的标准MT气体（30 ppmv）。从上海香杰香料厂获得丙二醇中的标准MT液体（10%w/w）。样品在HP-5毛细管柱中分离。选择1毫升气体和标准顶空体积，采用1:1分流进样。GC炉温程序设置为70°C，持续10分钟。
当检测液相中的MT时，采用顶空法。将含有MT的5 mL样品置于20 mL顶空GC样品瓶中。顶空进样器条件为：样品瓶压力14 psi，每个样品瓶提取两次，炉温60°C，定量环温度75°C，传输线温度85°C，样品瓶平衡15分钟，样品瓶加压0.1分钟，定量环填充0.15分钟，定量环平衡0.05分钟，样品进样1分钟，GC循环15分钟。
为获得液相MT的校准曲线，选择2000、1600、1200、800、400、200和100 ppm MT作为通过顶空进样器进样的标准样品。通过使用气密注射器直接进样气相色谱法测定气相中的MT浓度。选择30、25、15、10、5、2和0.5 ppmv的MT浓度作为数据点，以获得气相MT的校准曲线。获得的校准曲线为A=9959.9C（液相）和A=394.6C（气相）。两条校准曲线的相关系数均大于0.99；因此，它们都适用于MT检测。
2.5.发酵过程中CZ05菌株的特性表征
使用1号至4号培养介质来表征CZ05菌株在不同营养环境中的生长情况。在4号介质培养过程中，选择pH范围3-12作为CZ05菌株的培养条件。使用微生物读数器和pH计测量CZ05菌株的生长情况。
在pH 7.0下，使用两种介质（1号和4号）进行分批培养程序，用于生物降解测试。MT浓度为100毫克在100毫升无机培养基中（1000 ppm）。用纯菌株CZ05接种培养物。同时准备空白培养物（无细菌）。将培养物在250 mL密封烧瓶中的100 mL培养基中培养，并在120 rpm和30°C下振荡。通过顶空GC检测培养物中MT浓度的变化。同时使用分光光度计通过测量600 nm处的光密度来监测菌株生长。用pH计测量介质中pH的变化。
2.6.生物滴滤池
构建了一个串联操作的生物滴滤池，由两个填充有火山石（直径8毫米至10毫米）的塔（直径38毫米x高800毫米）组成。两个塔各连接一个相分离器和一个生物反应器。相分离器用于分离循环流体中的固体颗粒。生物反应器用于培养菌株并维持塔内的温度。生物滴滤池的示意图如图1所示。
图1. 实验室规模生物滴滤塔示意图
含MT的氮气（模拟沼气）在室温下从第一个塔的底部供应。氮气流速以空床停留时间表示。储存在第一个生物反应器中的生长培养基被循环利用，以滋养固定在火山石上的细胞，并去除第一个塔中产生的硫颗粒和硫酸盐。将空气流鼓入第一个生物反应器，通过液体流动为固定在第一个塔中的细胞提供氧气。来自第一个生物反应器的含MT废气在室温下供应到第二个塔的底部，以去除剩余的MT。储存在第二个生物反应器中的介质被循环利用，为固定在第二个塔中的细胞提供营养。通过将过滤器在LB培养基中浸泡3小时（OD600约为1.0的CZ05肉汤500 mL）来接种两个填充塔。在操作系统中循环3升1号或4号培养基。当火山石上出现细菌菌落时，用3升新鲜培养基完全更换循环培养基。此时，24小时生物膜培养阶段完成。含MT的氮气从第一个填充塔的底部供应。将空气鼓入第一个生物反应器，然后进入第二个塔。通过GC检测两个塔中MT的进出口浓度。
2.7.降解途径的操作
当串联操作的生物滴滤池运行稳定35小时后，进气流的增加（浓度未增加）导致第一个塔出口MT浓度明显增加。第一个塔的进口MT浓度略有增加（气流未增加），但第二个塔的进口MT浓度明显增加。这种现象的发生可能是因为MT从气相到液相的转移在第一个塔中需要30秒；然而，由于存在某种增加MT溶解度的特定物质，溶解平衡未能达到。
第一个塔中的MT代谢物用于测试降解途径。通过顶空GC-MASS检测液相中的挥发性物质。通过离子色谱法测量硫酸盐和硫代硫酸盐浓度。基于硫质量平衡计算硫浓度。
2.8.MT氧化酶提取物的制备
通过将CZ05细胞悬浮在50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）中，并用高压均质机在130 MPa下破碎它们来制备细胞内酶提取物。在4°C下以40,000g离心30分钟后获得的上清液直接用于酶测定。通过将培养液在4°C下以10,000g离心30分钟并提取上清液供后续使用来制备细胞外酶提取物。
2.9.H2S的添加
将H2S（0-500 ppm）逐渐加入到第一个塔入口的气流中，以研究H2S对MT降解的影响。通过GC检测入口和出口处的MT和H2S浓度。修改鼓入第一个生物反应器的空气流量，并检测第一个生物反应器broth中的溶解氧。
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