抗生素敏感性试验
在30°C孵育24小时后，将细胞离心并从含有盐水的培养基中去除。将麦氏浊度为0.5的接种物悬浮液小心地涂布在含有4毫米厚MRS琼脂的平板上。当悬浮液被琼脂吸收后，将带有抗生素的纸片一式三份分布。红霉素E15、卡那霉素K30、杆菌肽B10、链霉素S10、阿莫西林AML25、四环素TE30、甲氧苄啶WE、青霉素P10、吡利霉素PIR2、氯霉素C30和萘啶酸NA30购自Oxoid。
统计分析
所有测量值均为平均值±标准差。使用Excel统计包分析数据。统计显著性通过学生t检验确定，设定为P=w0.01。
GeneBank登录号
植物乳杆菌FPL 16S rRNA基因的GeneBank登录号：KY883188。由于获得的16S rRNA基因序列相同，仅包含该组的一个代表。
结果与讨论
通过MALDI-TOF进行物种鉴定
通过MALDI-TOF对49个菌株进行了鉴定，获得的光谱与Brucker数据库进行了比对。分离菌株的光谱具有超过两分的高鉴定概率（实验一式三份进行）。对46个菌株光谱的分析表明为植物乳杆菌，另外三个光谱分别对应于溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和蒙氏肠球菌。根据Brucker数据库，几乎所有分离株都表明是植物乳杆菌；只有三个分离株显示出其他物种，但它们可以被视为污染。结果表明植物乳杆菌在蜜露环境中占主导地位。随后，将新FPL菌株的光谱与参考菌株进行比对，某些峰的位移表明蛋白质发生了修饰。MALDI Biotyper对光谱的分析表明，某些蛋白质的表面发生了修饰，这可能解释了其对富含果糖环境的适应。MALDI-TOF分析的结果揭示了九个初步鉴定为植物乳杆菌的分离株，具有最高的鉴定概率得分。
通过16S rRNA基因测序和多重PCR进行物种鉴定
通过分析16S rRNA基因序列对来自蜜露的九个植物乳杆菌分离株进行了鉴定。获得的DNA序列通过BLAST与核苷酸基因库进行比对；结果显示所有菌株与植物乳杆菌、副植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的相似性均>99%。为了确认分离株的物种归属，进行了多重PCR。recA基因的多重PCR反应产物长度约为310 bp，对植物乳杆菌物种具有特异性（图1）。
图1多重PCR检测扩增产物结果。第1泳道为1 kb Ladder Perfect Plus分子量标准（Eurx公司，波兰格但斯克）。第2泳道显示植物乳杆菌FPL株的扩增产物，长度为295.53 bp；第3泳道为植物乳杆菌FPL1株的扩增产物，长度295.56 bp；第4泳道为植物乳杆菌FPL2株（295.6 bp）；第5泳道为植物乳杆菌FPL3株（298 bp）；第6泳道为植物乳杆菌；$FPL4 298.5；第7行植物乳杆菌FPL5 294 bp；第8行植物乳杆菌$FPL6 296 bp；第9行植物乳杆菌FPL7 299 bp；第10行植物乳杆菌FPL8 308 bp；第11行植物乳杆菌FPL9 310 bp。碱基对长度/数量通过Quantity One软件（美国伊利诺伊州Bio-Rad公司）测定。
使用邻接法构建的系统发育树显示了与植物乳杆菌FPL最接近的菌株以及果果杆菌属物种的位置。库克乳杆菌是来自FLAB组中最近的系统发育邻居（图2）。在关于FLAB的第一份报告中，描述了在各种培养基上的生长；鉴定了16S rRNA基因，并表征了一些生化和嗜果糖特性。在本文中，进行了Endo提出的研究。我们还使用了MALDI-TOF和多重PCR，这使得鉴定来自蜜露的菌株成为可能。所有这些方法都有助于快速有效地选择菌株进行进一步研究。
表1利用Hi-Carbo试剂盒（HiMedia公司）测定的植物乳杆菌FPL与植物乳杆菌NRRL B-4496碳源利用谱
生化特性
植物乳杆菌FPL菌株利用表1中所示的碳水化合物。不同菌株还能够利用木糖、半乳糖、棉子糖、甘油和阿东醇，这可能表明单个分离株的差异性。参考菌株植物乳杆菌NRRL B-4496在碳水化合物利用方面没有显示出差异，除了菊粉、棉子糖和甘露醇，这些仅被嗜果糖植物乳杆菌FPL利用。
API ZYM的结果揭示了酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、脂肪酶(C14)、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的产生。这些菌株没有碱性磷酸酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-甘露糖苷酶和α-岩藻糖苷酶的活性。Siezen等人进行的研究测试了185株植物乳杆菌的碳水化合物利用；所有菌株都降解海藻糖、蔗糖、松三糖（除一株外）和山梨糖醇，与植物乳杆菌FPL菌株相似。在甘露醇和菊粉的情况下存在差异；本研究表明，只有植物乳杆菌FPL菌株利用这些碳水化合物，这些碳水化合物通常出现在植物环境中。
然而，植物乳杆菌物种利用菊粉并不是唯一的，因为已有报道其他菌株降解草果聚糖和菊粉。相比之下，植物乳杆菌FLP菌株的不同碳水化合物代谢可能性显著高于FLAB组，因为后者细菌不降解水杨苷、山梨糖醇、纤维二糖和松三糖。FLAB组中的所有物种都可以代谢甘露醇和果糖，与植物乳杆菌FPL菌株的嗜果糖特性相同。这些菌株不表现出酸性磷酸酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，这些活性存在于大多数果果杆菌物种中。植物乳杆菌FPL具有β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，与果果杆菌属不同，这可能通过代谢副产物引起这些细菌之间的共生相互作用。
抗生素敏感性试验
表2九株分离植物乳杆菌FPL的抗生素敏感性
| 抗生素 | 抗生素浓度 | 平均抑菌圈直径 A(mm) 和标准差 SD(mm) | |||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FPL | FPL1 | FPL2 | FPL3 | FPL4 | FPL5 | FPL6 | FPL7 | FPL8 | 总计 | ||||||||||||
| A SD | A | SD | A | SD | A | SD | A | SD | A | SD | A | SD | A | SD | A | SD | A | SD | |||
| 红霉素 E15 | 15μg | 30.37 | 0.26 | 28.83 | 0.24 | 30.67 | 0.94 | 22.67 | 0.47 | 19.67 | 0.47 | 26.33 | 0.47 | 29.67 | 0.62 | 29.03 | 0.73 | 26.60 | 1.18 | 27.09 | 0.29 |
| 卡那霉素 K30 | 30μg | 10.17 | 0.24 | 9.37 | 0.26 | 8.00 | 0.71 | 8.33 | 0.47 | 9.87 | 0.19 | 8.30 | 1.28 | 7.00 | 0.00 | 8.10 | 0.54 | 9.50 | 0.71 | 8.74 | 0.36 |
| 杆菌肽 B10 | 10 单位 | 21.87 | 0.66 | 22.83 | 1.43 | 11.67 | 0.47 | 16.00 | 1.41 | 17.50 | 0.41 | 13.17 | 3.06 | 20.67 | 1.25 | 19.83 | 0.62 | 19.20 | 1.57 | 18.08 | 0.78 |
| 链霉素 S10 | 10μg | 12.83 | 0.62 | 14.93 | 0.33 | 8.50 | 0.41 | 10.33 | 0.47 | 10.50 | 0.71 | 12.17 | 0.85 | 9.90 | 1.58 | 11.17 | 1.43 | 9.50 | 1.87 | 11.09 | 0.53 |
| 阿莫西林 AML25 | 25μg | 37.60 | 0.22 | 36.20 | 0.59 | 27.50 | 1.22 | 30.33 | 3.77 | 31.67 | 1.25 | 29.33 | 0.47 | 30.83 | 0.85 | 34.00 | 0.82 | 31.67 | 2.49 | 32.13 | 1.07 |
| 四环素 TE30 | 30μg | 22.10 | 0.54 | 22.60 | 1.13 | 17.00 | 2.45 | 15.67 | 0.47 | 20.53 | 0.41 | 24.83 | 0.62 | 23.17 | 1.93 | 18.83 | 1.65 | 21.00 | 1.63 | 20.64 | 0.70 |
| 甲氧苄啶 WE | 5μg | 25.13 | 0.81 | 25.00 | 0.00 | 24.50 | 1.08 | 25.00 | 0.00 | 22.97 | 0.82 | 21.33 | 1.43 | 19.00 | 0.71 | 20.27 | 0.21 | 20.50 | 0.41 | 22.63 | 0.46 |
| 青霉素 P10 | 10 单位 | 24.17 | 0.24 | 26.63 | 0.45 | 24.00 | 0.82 | 20.00 | 0.00 | 22.83 | 0.62 | 20.67 | 3.30 | 19.00 | 0.82 | 25.47 | 0.34 | 19.00 | 2.16 | 22.42 | 1.01 |
| 吡利霉素 PIR2 | 2μg | 8.33 | 0.47 | 9.83 | 1.18 | 21.67 | 0.47 | 11.83 | 0.62 | 8.17 | 0.62 | 8.30 | 0.99 | 10.33 | 0.47 | 9.17 | 0.24 | 10.00 | 0.82 | 10.85 | 0.28 |
| 氯霉素 C30 | 30μg | 31.67 | 0.47 | 21.83 | 1.43 | 23.83 | 0.85 | 23.00 | 0.71 | 31.67 | 0.94 | 29.23 | 1.58 | 22.83 | 1.65 | 24.67 | 2.62 | 31.00 | 1.41 | 26.64 | 0.61 |
| 萘啶酸 NA30 | 30μg | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
如表2所示，单个菌株之间的抗生素敏感性略有不同。这些菌株对除萘啶酸外的本研究中使用的所有抗生素均敏感。抗生素敏感性测试表明，植物乳杆菌菌株是安全的，这是确定其益生菌潜力的第一步。先前已对与昆虫密不可分且具有昆虫益生菌潜力的FLAB进行了抗生素敏感性测试。此外，FLAB可以产生和利用支持蜜蜂核心肠道微生物组生长的物质。